WłAŚciwości fizyko-chemiczne wód nastoinowych I cytometria przepływowa w ocenie żywotności I wigoru nasion


ROLA CENTRALNYCH I OBWODOWYCH NARZĄDÓW LIMFATYCZNYCH W POWSTAWANIU RADIALNEJ SEGMENTACJI (RS) JĄDER ORAZ KSZTAŁTOWANIU AKTYWNOŚCI FOSFATAZY KWAŚNEJ W LIMFOCYTACH KRWI KURCZĄT IMMUNIZOWANYCH



Pobieranie 339.15 Kb.
Strona2/4
Data25.02.2018
Rozmiar339.15 Kb.
1   2   3   4

ROLA CENTRALNYCH I OBWODOWYCH NARZĄDÓW LIMFATYCZNYCH W POWSTAWANIU RADIALNEJ SEGMENTACJI (RS) JĄDER ORAZ KSZTAŁTOWANIU AKTYWNOŚCI FOSFATAZY KWAŚNEJ
W LIMFOCYTACH KRWI KURCZĄT IMMUNIZOWANYCH


Aleksandra Pliszczak-Król

Streszczenie. Oceniano zdolność tworzenia radialnej segmentacji jąder (RS) oraz aktywność fosfatazy kwaśnej (Fk) w limfocytach krwi kurcząt, którym operacyjnie usunięto centralne (grasicę, torbę Fabrycjusza) lub obwodowe (śledzionę) narządy limfatyczne. Kurczęta te w 6 tygodniu życia dodatkowo immunizowano LPS lub SRBC. Zabiegi usunięcia centralnych narządów (tymektomię i bursektomię) przeprowadzono w 1 dobie
życia kurcząt. Splenektomii (zabiegowi usunięcia śledziony) poddano kurczęta
3-tygodniowe. Materiał do badań stanowiła krew pobrana od kurcząt doświadczalnych w 6 dniu po stymulacji antygenowej. Wykonano test spontanicznej i indukowanej radialnej segmentacji jąder oraz cytochemiczne oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej w limfocytach pobranej krwi. Wykazano, że u kurcząt operowanych, poddanych immunizacji zdolność tworzenia RS oraz aktywność Fk w limfocytach są zróżnicowane. Uzależnione jest to od rodzaju wykonanego zabiegu operacyjnego oraz w pewnym stopniu – od rodzaju antygenu użytego do stymulacji. Zmieniona zdolność tworzenia jąder segmentowanych oraz zmiany aktywności fosfatazy kwaśnej są prawdopodobnie skutkiem defektu funkcjonalnego i zaburzeń kooperacji limfocytów, spowodowanych brakiem oddziaływania narządów limfatycznych. Stwierdzono też, że istotny wpływ na RS i aktywność Fk wywiera stan układu immunologicznego ptaków doświadczalnych w momencie immunizacji.

Słowa kluczowe: limfocyty, bursektomia, tymektomia, splenektomia, radialna segmentacja, fosfataza kwaśna, antygeny, LPS, SRBC

Wstęp


W układzie limfatycznym kręgowców podstawową rolę pełnią limfocyty. Komórki te dojrzewają w centralnych narządach limfatycznych, a następnie migrują i zasiedlają odpowiednio: strefy grasiczozależne (limfocyty T) i strefy grasiczoniezależne (limfocyty B) narządów limfatycznych obwodowych. Obecność w narządach limfatycznych obu populacji limfocytów, jak również makrofagów i komórek dendrytycznych zapewnia funkcjonowanie i optymalną kooperację wszystkich komórek, co jest niezbędnym warunkiem zainicjowania rozwoju i przebiegu odpowiedzi immunologicznej [Graczyk 1994, Graczyk i Kuryszko 1995, Madej i Graczyk 1997].

Reaktywność komórek układu immunologicznego zależy od rozwoju i stanu funkcjonalnego narządów limfatycznych [Graczyk 1994, Graczyk 1998, Graczyk i Kuryszko 1995, Graczyk i in. 1998, Marsh 1993, Paramithiotis i Ratcliffe 1994]. W centralnych narządach limfatycznych (CNL) prekursory limfocytów nabierają odmiennych właściwości – zyskują swoiste piętno, które decyduje o ich dalszym losie [Glick 1995, Graczyk 1985, Hirota i Bito 1975, Madej i Graczyk 1997, Marsh 1993, Paramithiotis i Ratcliffe 1994, Radziszewska 1995]. Obwodowe narządy limfatyczne (ONL) są miejscem interakcji z antygenem, aktywacji, proliferacji, dojrzewania i śmierci limfocytów [Graczyk 1994].

Wśród wielkiej i zróżnicowanej ewolucyjnie grupy zwierząt, jakimi są kręgowce, bardzo interesującą grupę, biorąc pod uwagę budowę układu limfatycznego, stanowią ptaki. W odróżnieniu od ssaków, u ptaków miejscem dojrzewania limfocytów B, jest workowaty uchyłek kloaki nazwany torbą Fabrycjusza [Glick 1995, Madej i Graczyk 1997, Paramithiotis i Ratcliffe 1994]. Wykazano, że pozbawienie ptaków torby Fabrycjusza prowadzi do upośledzenia a nawet zahamowania produkcji przeciwciał [Graczyk 1985, Hirota i Bito 1975], przy nieznacznym wpływie na odporność typu komórkowego [Madej i Graczyk 1997]. Stopień upośledzenia odpowiedzi humoralnej po bursektomii zależy od czasu i techniki przeprowadzenia tego zabiegu [Hirota i Bito 1975]. Z kolei po usunięciu grasicy dochodzi do osłabienia lub zniesienia odpowiedzi typu komórkowego [Graczyk i Kuryszko 1995, Madej i Graczyk 1997, Marsh 1993], bez wyraźnych zmian w zakresie odporności humoralnej, co próbuje się tłumaczyć zaburzeniem kooperacji limfocytów [Madej i Graczyk 1997].

U większości gatunków ptaków, pozbawionych węzłów chłonnych, rolę obwodowego narządu limfatycznego pełni miazga biała śledziony [Graczyk i in. 1998]. To w tym narządzie, szczególnie po dożylnym podaniu antygenu, ma miejsce klonalna proliferacja i selekcja komórek produkujących przeciwciała o wysokim powinowactwie do antygenu [Graczyk i in. 1998]. We wcześniejszych badaniach własnych stwierdzono, że po usunięciu śledziony (splenektomii) dochodzi do upośledzenia syntezy przeciwciał. Nie notowano przy tym zmian w przebiegu odpowiedzi typu komórkowego. Wykazano natomiast, że u kurcząt splenektomowanych dochodzi do zmian proliferacyjnych oraz pobudzenia komórek w grasicy i torbie Fabrycjusza, które jednak nie rekompensują braku śledziony [Graczyk i in. 1998]. Te i inne spostrzeżenia wskazują na istnienie wzajemnych i dwustronnych zależności pomiędzy centralnymi i obwodowymi narządami limfatycznymi [Graczyk 1985, Graczyk i Kuryszko 1995, Graczyk i in. 1998, Heller i Perek 1973].

Przebieg i charakter odpowiedzi immunologicznej warunkowane są stopniem dojrzałości limfocytów oraz ich zdolnością do rozpoznawania i reagowania na antygeny – substancje traktowane przez ustrój jako „obce” [Madej i Graczyk 1997]. Z dojrzewaniem limfocytów i ich zaangażowaniem w procesach immunologicznych związane są zmiany w morfologii i w wyposażeniu enzymatycznym tych komórek. W szczególności dotyczą one enzymów aparatu lizosomalnego [Graczyk 1985, Graczyk 1998, Graczyk i Kuryszko 1995]. Do enzymów lizosomalnych zaliczana jest m.in. fosfataza kwaśna (Fk), uznawana za marker tych struktur komórkowych [Graczyk 1985, Graczyk 1994]. Jej rola biologiczna w limfocytach nie jest ostatecznie wyjaśniona. Zmiany aktywności Fk stwierdzono w trakcie dojrzewania układu immunologicznego oraz w przebiegu transformacji blastycznej limfocytów [Graczyk 1994, Graczyk 1998]. Pojawiają się one także w odpowiedzi na stymulujące działanie antygenów [Graczyk 1994, Graczyk 1998]. Zmiany aktywności fosfatazy kwaśnej obserwowano w przewlekłej białaczce limfatycznej, w chorobach alergicznych oraz przy osłabieniu mechanizmów odpornościowych u osobników starszych [Graczyk 1994, Graczyk 1998]. Przyjęto, że oznaczanie aktywności Fk może być wskaźnikiem wzrostu i dojrzałości układu immunologicznego oraz odzwierciedleniem stanu czynnościowego limfocytów [Graczyk 1985, Graczyk 1998, Graczyk i Kuryszko 1995].

Zmiany w limfocytach, pojawiające się w wyniku oddziaływania różnych czynników zewnętrznych i wewnętrznych, wiążą się nie tylko ze zmianami enzymatycznymi. Może towarzyszyć im reorganizacja pozostałych struktur komórkowych, w tym także cytoszkieletu [Anand i Iih Nan Chou 1993, Ostrowski 1995]. Cytoszkielet stanowi trójwymiarową sieć, występującą w komórkach eukariotycznych, utworzoną z elementów włóknistych: mikrotubul, filamentów pośrednich i mikrofilamentów [Czyż 1995, Jagła i in. 1991]. Okazuje się, że nie jest on strukturą statyczną, nadającą jedynie odpowiedni kształt komórce [Czyż 1995]. Może ulegać ciągłej, dynamicznej reorganizacji [Ding i in. 1995, Mandelkow i in. 1991]. Odpowiednia organizacja przestrzenna włókien cytoszkieletu umożliwia zdolność adhezji do podłoża, co jest komórce niezbędne do wzrostu i różnicowania [Czyż 1995, Jagła i in. 1991, Ostrowski 1995, Pardi i in. 1992]. Poszczególne włókna, m.in. mikrotubule biorą udział w przewodzeniu informacji z błony komórkowej do jądra (transdukcja sygnału mitotycznego) i indukcji odpowiedzi biochemicznej (indukcja syntezy DNA i białek) [Anand i Iih Nan Chou 1993, Czyż 1995, Jagła i in. 1991, Mandelkow i in. 1991, Ostrowski 1995, Pardi i in. 1992, Radziszewska 1995]. Mikrofilamenty pośrednio koordynują reakcje enzymatyczne, zapewniając odpowiednią kompartmentację enzymów, m.in. glikolitycznych, przez co mają wpływ na regulację glikolizy i procesów energetycznych [Czyż 1995]. Mikrotubule natomiast uczestniczą w transporcie enzymów między poszczególnymi przedziałami oraz w transporcie enzymów lizosomalnych [Czyż 1995, Kreis 1990]. Mikrofilamenty w połączeniu z odpowiednimi białkami (żelzoliną, wiliną, kalmoduliną) zmieniają stopień żelifikacji cytoplazmy, co jest istotne dla przebiegu procesów biochemicznych w komórce [Czyż 1995]. Architektura cytoszkieletu decyduje o organizacji cytoplazmy komórkowej [Czyż 1995, Ding i in. 1995]. Białka budujące elementy włókniste cytoszkieletu mają zdolność integracji z organellami komórkowymi: mitochondriami, lizosomami, retikulum endoplazmatycznym, aparatem Golgiego [Czyż 1995, Kreis 1990, Morris i Hollenbeck 1995].



O udziale cytoszkieletu w procesach metabolicznych świadczy fakt występowania zmian w budowie i organizacji jego struktur obserwowany w komórkach w różnych procesach patologicznych (np. nowotwory, mononukleoza zakaźna, cukrzyca) [Anand i Iih Nan Chou 1993, Ding i in. 1995, Jagła i in. 1991]. Knox i in. [1993] badając wpływ taxolu i hipertermii na procesy polaryzacji cytotoksycznych limfocytów T zauważyli, że w komórkach tych utrata i odtworzenie przestrzennej organizacji mikrotubul przebiega równolegle z utratą i odzyskaniem aktywności cytolitycznej. Mikrotubule nie są elementami stabilnymi [Mandelkow i in. 1991]. Wykazują niezwykłą właściwość ciągłej zmiany swej długości wskutek fazowo przebiegających procesów polimeryzacji i depolimeryzacji [Ding i in. 1995, Mandelkow i in. 1991]. Stan tej dynamicznej „niestabilności” jest stwierdzany nawet przy stałych warunkach, zarówno in vivo, jak i in vitro [Mandelkow i in. 1991].

Ze zwiększoną depolimeryzacją mikrotubul związane jest występowanie głębokich szczelin w jądrze komórek jednojądrzastych krwi obwodowej człowieka i zwierząt. Szczeliny te, zbiegając się koncentrycznie w centrum komórki, dzielą jądro na kilka płatów i upodabniają je do np. ósemki lub liścia koniczyny (rys. 1) [Inoue 1988, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973, Simmingsköld i in. 1981, Valmin 1976].

Rys. 1. Limfocyt wykazujący radialną segmentację – schemat za Norbergiem, w modyfikacji własnej. Objaśnienia: a – płat jądra, b – szczeliny międzysegmentalne, c – wiązka mikrotubuli opasujących jądro, d – centriola

Fig . 1. Lymphocyt with radial segmentation of nuclei – Norberg’s scheme in own modification. Explanations: a – the nuclear lobe, b – the intersegmental clefts, c – the bundle of microtubules encircling the nucleus, d – the centriole


Söderström, Norberg i in. zjawisko to nazwali radialną segmentacją jąder (RS) [Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967, Starzyńska i Kieszek 1988]. Tego rodzaju „deformację” jądra obserwowano w limfocytach białaczkowych, w innych komórkach nowotworowych, w limfocytach i monocytach napromieniowanych lub zainfekowanych wirusami, w limfocytach osób chorych na mononukleozę zakaźną [Cawley 1972, Graczyk i in. 1998, Inoue 1988, Ito 1974, Neftel i in. 1983, Norberg 1969, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973, Simmingsköld i in. 1981, Valmin 1976]. Okazało się, że zjawisko radialnej segmentacji jąder limfocytów może pojawiać się spontanicznie. Można je też indukować in vitro inkubując krew w środowisku zawierającym antykoagulanty, szczególnie wiążące jony Ca+2, np. szczawiany. Przy czym zdolność limfocytów do tworzenia indukownej chemicznie RS okazuje się zależeć od wielu czynników, a mechanizm jej powstawania jest złożony [Borucka-Sztobryn 1985, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Ito 1974, Norberg 1969, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967, Pliszczak-Król i Graczyk 1995, Starzyńska i Kieszek 1988].

Początkowo sugerowano, iż RS jest efektem zaburzonej mitozy lub amitozy [Borucka-Sztobryn 1985, Ito 1974, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967], podczas których dochodzi do przedwczesnego i niepełnego podziału jądra [Norberg i Söderström 1967]. Późniejsze badania wykazały jednak, że w komórkach z RS


błona jądrowa i nukleoplazma są nienaruszone [Norberg i Söderström 1967]. Nie stwierdzono także formowania się chromosomów, co jest niezbędne przy podziale mitotycznym komórek [Norberg i Söderström 1967]. Norberg i Söderström sugerowali początkowo, że pojawienie się szczelin w jądrze wynika ze skurczu włókien połączonych z błoną jądrową i innymi strukturami wewnątrzjądrowymi [Norberg i Söderström 1967]. Później jednak zauważono, iż czynnik powodujący powstawanie szczelin działa na jądro od zewnątrz, tj. od strony cytoplazmy [Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967]. Wykazano, że do podziału na segmenty dochodzi w trakcie skurczu filamentów opasujących jądro [Ito 1974, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967]. Sama zaś RS spowodowana jest kurczeniem się, w wyniku powolnego rozpadu, mikrotubul wychodzących z rejonu centrosomu na jednym biegunie a schodzących się w podobnym miejscu na drugim biegunie komórki [Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Norberg 1969, Norberg 1970, Norberg 1967, Norberg i Söderström 1967]. Opasujące jądro mikrotubule uważane są za pozostałość wrzeciona podziałowego [Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Norberg 1969, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973, Valmin 1976]. Przedstawiono to schematycznie na rysunku 1. Za udziałem mikrotubul w mechanizmie powstawania RS przemawiają też wyniki badań nad wpływem substancji hamujących podział komórek – blokerów metafazalnych [Borucka-Sztobryn 1985, Norberg 1969, Norberg 1970, Sikora 1996]. Substancje takie jak kolchicyna, demekolina, podofilina, doprowadzając do przyśpieszonego rozpadu mikrotubul wrzeciona podziałowego, blokują podział komórki a równocześnie hamują powstawanie radialnej segmentacji [Borucka-Sztobryn 1985, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Ito 1974, Norberg 1969, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973]. Uderzające podobieństwo rozmieszczenia mikrotubul w komórkach z jądrem segmentowanym, u ludzi chorych na białaczkę i w komórkach, w których segmentację jądra indukowano szczawianami, przemawia za udziałem tych struktur włóknistych w procesie tworzenia RS [Cawley 1972, Norberg 1969, Valmin 1976]. Zauważono również, że cytoplazma komórek z jądrem segmentowanym jest silnie zwakuolizowana i posiada zwiększoną ilość protofilamentów, podjednostek wykorzystywanych do budowy mikrotubul [Norberg 1970].

Obok procesów, które cechuje zwiększona zdolność komórek do tworzenia szczelin w jądrze, opisano również takie, w których obserwowano upośledzenie powstawania RS. Na tej podstawie niektórzy sugerują, iż u człowieka zjawisko RS może być obiektywnym przejawem zmienionej odczynowości limfocytów [Borucka-Sztobryn 1985, Starzyńska i Kieszek 1988].

W dostępnej literaturze, tylko nieliczne dane dotyczą radialnej segmentacji jąder limfocytów krwi obwodowej u zwierząt. We wcześniejszych badaniach własnych
[Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Pliszczak-Król i Graczyk 1995] wykazano, że zjawisko to występuje także u ptaków. W niewielkim zakresie RS pojawia się spontanicznie, ale może być indukowana na drodze chemicznej.

W zaplanowanym układzie doświadczalnym podjęto więc badania mające na celu ocenę zdolności tworzenia radialnej segmentacji jąder (RS) w zestawieniu z aktywnością fosfatazy kwaśnej (Fk) w limfocytach krwi kurcząt, którym:



  • zmieniono czynność układu limfatycznego poprzez operacyjne usunięcie narządów limfatycznych,

  • stymulowano czynność komórek limfatycznych, podając wybrane antygeny.


Pobieranie 339.15 Kb.

Share with your friends:
1   2   3   4




©operacji.org 2020
wyślij wiadomość

    Strona główna
warunków zamówienia
istotnych warunków
przedmiotu zamówienia
wyboru operacji
Specyfikacja istotnych
produktu leczniczego
oceny operacji
rozwoju lokalnego
strategii rozwoju
kierowanego przez
specyfikacja istotnych
Nazwa przedmiotu
Karta oceny
ramach działania
przez społeczno
obszary wiejskie
dofinansowanie projektu
lokalnego kierowanego
Europa inwestująca
Regulamin organizacyjny
przetargu nieograniczonego
kryteria wyboru
Kryteria wyboru
Lokalne kryteria
Zapytanie ofertowe
Informacja prasowa
nazwa produktu
Program nauczania
Instrukcja obsługi
zamówienia publicznego
Komunikat prasowy
programu operacyjnego
udzielenie zamówienia
realizacji operacji
opieki zdrowotnej
przyznanie pomocy
ramach strategii
Karta kwalifikacyjna
oceny zgodno
Specyfikacja techniczna
Instrukcja wypełniania
Wymagania edukacyjne
Regulamin konkursu
lokalnych kryteriów
strategia rozwoju
sprawozdania finansowego
ramach programu
ramach poddziałania
kryteriów wyboru
operacji przez
trybie przetargu