Plan naukowy


KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 1.1 1/006/2010



Pobieranie 484.32 Kb.
Strona3/17
Data30.10.2017
Rozmiar484.32 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   17

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 1.1 1/006/2010


(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 1.1 w Planie Naukowym 2013

PRACA KONTYNUOWANA – Nr 1.1 w Planie Naukowym 2014)

Epidemiologia chorób nowotworowych układu krwiotwórczego
Wstęp: W Instytucie Hematologii i Transfuzjologii został utworzony Rejestr Zachorowań na Ostre Białaczki u Dorosłych w Polsce, który w 2004 roku uzyskał akceptację Generalnego Inspektora Ochrony Danych Osobowych. Rejestr opierał się na zgłoszeniach zachorowań przesyłanych ze wszystkich ośrodków hematologicznych w kraju.

Od 2013 włączymy do Rejestru dane dotyczące pacjentów leczonych z powodu wszystkich rodzajów nowotworów układu krwiotwórczego w Klinice Hematologii IHT. Dane będą zbierane na podstawie kart zgłoszenia nowotworu, przekazywanych do Zakładu Epidemiologii Centrum Onkologii. Dane zebrane na podstawie zgłoszeń posłużą analizie danych odnośnie struktury wiekowej chorych, podtypu poszczególnych nowotworów i rodzaju leczenia.



Hipoteza badawcza: Dane uzyskane z Rejestru i prowadzonych baz danych mogą być pomocne do oszacowania zapotrzebowania na specjalistyczne leczenie hematologiczne w kraju, w tym na wysokonakładowe procedury lecznicze, jak przeszczepianie szpiku. Dane te służyć również będą szacowaniu liczebności chorych w planowanych próbach klinicznych.

Dotychczasowa realizacja celów badania: W ramach dotychczasowej pracy zgromadzono, zarchiwizowano w bazie danych dane ankietowe z partycypujących ośrodków. Dane epidemiologiczne podlegają bieżącej analizie.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu wraz z uzasadnieniem: Podsumowanie danych z rejestru uzyskanych od 2004 roku oraz porównanie danych z rejestru z danymi uzyskanymi z NFZ. Dane NFZ mogą stanowić bardziej kompletne źródło informacji niż dane ankietowe. Od 2013 włączone zostaną do Rejestru dane dotyczące pacjentów leczonych z powodu wszystkich rodzajów nowotworów układu krwiotwórczego w Klinice Hematologii IHT.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Dane uzyskane z Rejestru i prowadzonych mogą być pomocne do oszacowania zapotrzebowania na specjalistyczne leczenie hematologiczne w kraju. Dane te służyć również będą szacowaniu liczebności chorych w planowanych próbach klinicznych.
Pozostały okres realizacji pracy w latach: 1 rok

Zadania do wykonania w 2015 r.: Porównanie danych z Rejestru Zachorowań na Ostre Białaczki u Dorosłych w Polsce z danymi z Rejestru NFZ.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Publikacja

Wykonawcy: K. Warzocha, I. Seferyńska, P. Juszczyński, E. Lech-Marańda, B. Kalinowska
KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 1.2 1/001/2013

(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 1.3 w Planie Naukowym 2013



PRACA KONTYNUOWANA – Nr 1.3 w Planie Naukowym 2014)

Weryfikacja wartości referencyjnych dla aktywności deaminazy porfobilinogenu

w erytrocytach oraz ocena przydatności oznaczania tego enzymu w diagnostyce pacjentów z ostrą przerywaną porfirią i członków ich rodzin
Wstęp: Ostra przerywana porfiria (AIP) jest jedną z czterech ostrych porfirii wątrobowych. Jest to choroba metaboliczna, uwarunkowana genetycznie, wywołana obniżoną aktywnością deaminazy porfobilinogenu (PBDG). Niedobór PBGD spowodowany jest mutacjami w genie kodującym ten enzym. Choroba charakteryzuje się okresami zaostrzeń i remisji. Pełnoobjawowe ataki AIP występują tylko u 10-20% nosicieli defektywnego genu. Osoby te mają postać jawną AIP. U 80-90% osób obciążonych AIP, choroba nigdy się nie ujawnia. Osoby te mają postać utajoną AIP. U pacjentów będących w okresie jawnym choroby diagnostyka opiera się na ocenie wydalania prekursorów porfiryn i porfiryn z moczem, które wielokrotnie przewyższa tu górną granicę normy. U większości pacjentów z utajoną postacią AIP wydalanie prekursorów porfiryn i porfiryn z moczem jest prawidłowe. U osób tych jedyną metodą wykrycia porfirii jest zbadanie aktywności PBGD w erytrocytach lub wykonanie badań genetycznych. W Pracowni Porfirii IHiT badanie aktywności PBGD w erytrocytach wykonywane jest od roku 1976. Badania genetyczne wprowadzono do rutynowej diagnostyki AIP od 2004 roku i do chwili obecnej przebadano ponad 1500 osób, w tym 515 pacjentów z utajona postacią AIP stwierdzoną wcześniej na podstawie badania aktywności PBGD w erytrocytach. W grupie 515 osób z utajoną postacią AIP u 94 z nich (18,25%) stwierdzono niezgodność między diagnozą postawioną na podstawie badania aktywności PBGD w erytrocytach a diagnozą postawioną na podstawie badania genetycznego. U osób tych aktywność PBGD w erytrocytach była obniżona, natomiast nie wykryto u nich mutacji w genie HMBS.

Hipoteza badawcza: Zakres wartości referencyjnych dla aktywności PBGD w erytrocytach stosowany do tej pory w Pracowni Porfirii IHiT jest zawyżony. Występują czynniki wewnątrz- lub wewnątrzustrojowe mogące wpływać na obniżenie aktywności PBGD w erytrocytach.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Wśród 25 osób z grupy badanej 7 osób miało postawione rozpoznanie utajonej postaci AIP na podstawie badań aktywności PBGD w erytrocytach przeprowadzonych w latach poprzednich. Aktywność enzymu u tych osób była obniżona i wahała się między 15,4 a 22,6 nmoli uro/ml RBC/h, średnia 17,9. U 6 z nich wynik badania aktywności PBGD w erytrocytach przeprowadzonego w roku 2013 był zbieżny do wyniku tego badania z lat poprzednich i wahał się między 12,2 a 20,6 nmoli uro/ml RBC/h, średnia 16,5. U 5 z tych osób w przeprowadzonych w 2013 roku badaniach genetycznych wykryto mutację w genie HMBS, natomiast u jednej osoby mutacji w genie HMBS nie wykryto. U jednej osoby wynik badania aktywności PBGD w erytrocytach przeprowadzonego w roku 2013 nie był zgodny z wynikiem tego badania z roku 2003 (odpowiedni 31,5 i 22,6 nmoli uro/ml RBC/h). U osoby tej nie wykryto mutacji w genie HMBS w przeprowadzonych w 2013 roku badaniach genetycznych. Wśród pozostałych 18 osób z grupy badanej u 5, na podstawie wystąpienia u nich objawów klinicznych AIP oraz wysokiego wydalania z moczem porfiryn i ich prekursorów, rozpoznano jawną postać choroby. Aktywność PBGD w erytrocytach u tych 5 osób wahała się między 17,2 a 28,8 nmoli uro/ml RBC/h, średnia 22,2. U wszystkich 5 osób z jawną postacią AIP wykryto mutację w genie HMBS w przeprowadzonych w 2013 roku badaniach genetycznych. U kolejnych 5 osób postawiono rozpoznanie utajonej postaci AIP. Były to osoby bezobjawowe z obniżoną aktywnością PBDG w erytrocytach wahającą się między 13,0 a 20,6 nmoli uro/ml RBC/h, średnia 17,9. U wszystkich 5 osób z utajoną postacią AIP wykryto mutację w genie HMBS w przeprowadzonych w 2013 roku badaniach genetycznych. Kolejne 7 osób rozpoznano jako zdrowe, nieobciążone AIP. Były to osoby bezobjawowe z prawidłową aktywnością PBDG w erytrocytach wahającą się między 30,0 a 42,1 nmoli uro/ml RBC/h, średnia 35,5. U wszystkich tych 7 osób nie wykryto mutacji w genie HMBS w przeprowadzonych w 2013 roku badaniach genetycznych. Podobnie nie wykryto mutacji w genie HMBS u jednej osoby, którą również zakwalifikowano do osób zdrowych, mimo obniżonej o około 30% aktywności PBGD w erytrocytach. W grupie kontrolnej wartość PBGD w erytrocytach wahała się między 15,9 a 51,8 nmoli uro/ml RBC/h, średnia 32,0.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu wraz z uzasadnieniem: brak

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Ustalenie nowych wartości referencyjnych dla aktywności PBGD w erytrocytach. Określenie czynników mogących wpływać na obniżenie aktywności PBGD w erytrocytach. Ocenienie przydatności oznaczania tego enzymu w diagnostyce pacjentów z ostrą przerywaną porfirią i członków ich rodzin.

Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane.

Referencje:

Puy H. Gouda L. Deybach J-Ch. Porphyrias. Lancet 2010, 375: 924-37.

Magnussen CR, Levine JB, Doherty JM, Cheesman JO, Tschudy DP: A red cell enzyme method for the diagnosis of acute intermittent porphyria. Blood 1974, 44: 875-868.

Mauzerall D, Granick S. The occurence and determination of δ-aminolevulinic acid and porphobilinogen in urine. J Biol Chem 1956, 219: 435-446.

Johnson PM, Perkins SL, Kennedy SW. A high-speed liquid-chromatographic method for measuring urinary porphyrins. Clin Chem. 1988 34(1):103-5.

Puy H, Deybach JC, Lamoril J, Robreau AM, Da Silva V, Gouya L, Grandchamp B, Nordman Y: Molecular epidemiology and diagnosis of PBG deaminase gene defects in acute intermittent porphyria. Am J Hum Genet 1997, 60: 1373-1383.


Pozostały okres realizacji pracy: 1 rok

Zadania do wykonania w 2015 roku: Przebadanie przynajmniej 16 osób z grupy badanej i 16 osób z grupy kontrolnej.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Praca przygotowana do druku.

Wykonawcy: A. Lipniacka, E. Ejchman-Pac, R. Wasilewski, J. Windyga

Temat 2 „Bezpieczna krew”



KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.1 2/001/2015

(PRACA NOWA)



Ocena nieinwazyjnej metody oznaczania stężenia hemoglobiny we krwi przy użyciu spektroskopowej metody (Haemospect)
Wstęp: Zgodnie z „Medycznymi zasadami pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiązujących w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi” (wydanie II, 2011 r.), opracowanymi na podstawie wytycznych zawartych w dyrektywach: 2002/98/WE, 2004/33/WE, 2005/61/WE, 2005/62/WE oraz w Ustawie o publicznej służbie krwi (Dz.U. z 1997 r. Nr 106, poz. 681 z późn. zm.) każdy dawca kwalifikowany jest do pobrania krwi na podstawie wywiadu medycznego, badania przedmiotowego oraz wyników badań laboratoryjnych. Podstawowym badaniem kwalifikującym każdorazowo dawcę do oddania krwi jest pomiar stężenia hemoglobiny. Obecnie badanie to jest wykonywane przy użyciu analizatorów hematologicznych wykonujących pełną morfologię krwi lub przy użyciu analizatora hematologicznego typu Hemocue, zaprojektowanego tylko do oznaczenia stężenia hemoglobiny. W obu przypadkach pobierane są próbki krwi: żylnej w przypadku konieczności oznaczenia pełnej morfologii i włośniczkowej (nakłucie opuszki palca) w przypadku oznaczania jedynie stężenia hemoglobiny. Oceniana metoda oznaczania stężenia hemoglobiny we krwi przy użyciu aparatu Haemospect nie wymaga pobierania krwi. Jest całkowicie nieinwazyjna, co znacznie zwiększa komfort dawcy. Pomiar stężenia hemoglobiny przy użyciu aparatu Haemospect odbywa się z wykorzystaniem metody spektroskopowej. W literaturze fachowej, odnoszącej się do krwiodawstwa, jest bardzo mało doniesień naukowych oceniających spektroskopową metodę pod katem jej przydatności w kwalifikowaniu dawców. Doniesienia te przedstawiają zasadność stosowania nieinwazyjnej metody przede wszystkim w przypadkach monitowania stężenia hemoglobiny u pacjentów z anemią.

Hipoteza badawcza: Jak przedstawiono w niektórych publikacjach naukowych, pomiar stężenia hemoglobiny przy użyciu aparatu Haemospect jest metodą przydatną w praktyce. Nie mniej jednak wyniki pilotażowych badań naukowych, przeprowadzonych dotychczas w niektórych regionalnych centrach krwiodawstwa i krwiolecznictwa, nie wykazały jednoznacznie możliwości stosowania tej metody do kwalifikowania dawców.

Cele badania: 1. Porównanie wyników badań wykonanych metodą nieinwazyjną przy użyciu aparatu Haemospect z wynikami uzyskanymi jednoczasowo przy użyciu rutynowo stosowanego analizatora hematologicznego. 2. Przeprowadzenie procesu walidacji metody (określenie precyzji – powtarzalności i odtwarzalności metody, określenie dokładności).

Plan realizacji projektu i metodyka: Porównanie wyników badań otrzymanych z próbek krwi pobranych od ochotników z wynikami stężenia hemoglobiny uzyskanymi jednoczasowo u tych ochotników za pomocą nieinwazyjnej metody przy użyciu aparatu Haemospect. Ze względu na różne kryteria akceptacji (stężenia hemoglobiny) kwalifikujące kobiety i mężczyzn do oddania krwi, analiza wyników przeprowadzana będzie oddzielnie w dwóch grupach badanych (kobiety, mężczyźni).

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Przeprowadzenie analizy wyników badań pozwoli odpowiedzieć na pytanie, czy nieinwazyjna metoda oznaczania stężenia hemoglobiny we krwi przy użyciu aparatu Haemospect może być stosowana w celu kwalifikacji dawców do pobrania krwi.

Rodzaj pracy: Badanie naukowe stosowane.

Referencje:

1. Pinto M, Barjas-Castro ML, Nascimento S, Falconi MA, Zulli R, Castro V.: The new noninvasive occlusion spectroscopy hemoglobin measurement method: a reliable and easy anemia screening test for blood donors. Transfusion 2013, 53(4):766-9.

2. Belardinelli A, Benni M, Tazzari PL, Pagliaro P: Noninvasive methods for haemoglobin screening in prospective blood donors. Vox Sang. 2013, 105(2):116-20.

3. Moon Jung Kim, Quehn Park, Myungheekim, Jeong Won Shin, and Hyun Ok Kim: Comparison of the Accuracy of Noninvasive Hemoglobin Sensor (NBM-200) and Portable Hemoglobinometer (HemoCue) with an Automated Hematology Analyzer (LH500) in Blood Donor Screening. Ann Lab Med. Jul 2013: 33 (4): 261-267.


Okres realizacji pracy: 1 rok.

Zadania do wykonania w 2015 r.: Całość pracy.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Raport.

Wykonawcy: E. Lachert, A. Płodzich, A. Rosiek, R. Pogłód, J. Kubis, J. Antoniewicz-Papis, M. Łętowska
KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.2 2/002/2015

(PRACA NOWA)



Analiza poważnych niepożądanych zdarzeń i poważnych niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych w Polsce w latach 2011-2014
Wstęp: Leczenie krwią i jej składnikami może ratować życie pacjenta, niesie jednak z sobą ryzyko wystąpienia niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych. Szczególny niepokój budzą reakcje poprzetoczeniowe o ciężkim przebiegu, w tym powikłania zakończone zgonem pacjenta, a także poważne niepożądane zdarzenia mogące prowadzić do ich wystąpienia.

Analiza wyników kontroli szpitali w zakresie krwiolecznictwa oraz monitorowanie krajowych systemów czuwania nad bezpieczeństwem krwi wykazują, że szpitale często nie stosują właściwych procedur z zakresu krwiolecznictwa, co w konsekwencji może przyczyniać się do wzrostu częstości występowania analizowanych zjawisk. W ramach systemu czuwania nad bezpieczeństwem krwi, IHiT dokonuje analizy dokumentacji poważnych niepożądanych zdarzeń i powikłań poprzetoczeniowych nadsyłanej przez centra krwiodawstwa i krwiolecznictwa. Dokumentacja ta nie ogranicza się tylko do zgłoszenia powikłania, ale również zawiera informacje pozwalające na analizę przyczyn wystąpienia danego zdarzenia/reakcji, związku przyczynowego reakcji z przetoczeniem składnika krwi, śledzenie losów chorego, a także podjęcie działań naprawczych i zapobiegawczych.



Hipoteza badawcza: Większość powikłań o ciężkim, potencjalnie śmiertelnym przebiegu, a także poważnych niepożądanych zdarzeń mogących prowadzić do ich wystąpienia, spowodowana jest błędem ludzkim. Zasadność przetoczeń składników krwi prowadzących do niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych budzi niejednokrotnie wątpliwości, co może wskazywać na niezgodne z aktualnymi zaleceniami stosowanie składników krwi.

Cele badania: Analiza przyczyn występowania poważnych niepożądanych zdarzeń i poważnych niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych, przy uwzględnieniu: zasadności decyzji przetoczenia składnika krwi; prawidłowości postępowania terapeutycznego; funkcjonowania systemu nadzoru sprawowanego przez centra krwiodawstwa i krwiolecznictwa oraz IHiT.

Plan realizacji projektu i metodyka: Praca ma charakter badania retrospektywnego. Materiał stanowić będzie dokumentacja dotycząca poważnych zdarzeń niepożądanych i poważnych reakcji poprzetoczeniowych nadsyłana do IHiT przez centra krwiodawstwa i krwiolecznictwa.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Analiza poważnych niepożądanych zdarzeń i poważnych niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych pozwoli na ustalenie najczęstszych przyczyn tych zdarzeń i wskazanie okoliczności sprzyjających ich wystąpieniu. Wyniki pracy przyczynią się do optymalizacji wytycznych dotyczących postępowania i doskonalenia systemu szkolenia lekarzy i pracowników służby krwi.

Rodzaj pracy: Badanie naukowe stosowane.

Referencje:

1. Murphy MF, Waters JH, Wood EM I wsp. Transfusing blood safely and appropriately. Brit Med J. 2013 Jul 16; 347:f4303. doi: 10.1136/bmj.f4303.

2. European Commission, SANCO, Brussels, 2013: Summary of the 2012 annual reporting of serious adverse events and reactions (SARE) for blood and blood components(data collected from 01/01/2011 to 31/12/2011)

http://ec.europa.eu/health/blood_tissues_organs/docs/blood_sare_2012_en.pdf

3. Wiersum-Osselton, JC, Faber JC, Politis C. Hemovigilance: is it making a difference to safety in the transfusion chain? LeidenUniversity Repository, Leiden. Short paper, VoxSanguinis 2012, DOI: 10.1111/j.1423-0410.2012.01659.x

4. Murphy MF, Stanworth SJ, Yazer M. Transfusion practice and safety: current status and possibilities for improvement.Vox Sang. 2011; 100: 46-59. doi: 10.1111/j.1423-0410.2010.01366.x.

5. Common approach for definition of reportable serious adverse events and reactions as laid down in the Blood Directive 2002/98/EC and Commission Directive 2005/61/EC; version 4 (2013) SANCO/D4/IS.

6. De Vries RRP, Faber JC and Strengers PFW. Haemovigilance: an effective tool for improving transfusion practice. VoxSanguinis 2011; 100: 60–67.


Okres realizacji pracy: 1 rok.

Zadania do wykonania w 2015 r.: Całość pracy.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Praca przygotowana do druku.

Wykonawcy: R. Pogłód, A. Rosiek, E. Lachert, P. Grabarczyk, B. Michalewska, M. Łętowska

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.3 2/003/2015

(PRACA NOWA)



Opracowanie metod identyfikacji dawców bez antygenów grupowych o wysokiej częstości występowania dla chorych immunizowanych
Wstęp: Chorzy, którzy ulegli immunizacji antygenami erytrocytów o wysokiej częstości występowania stanowią istotny problem dla transfuzjologów. Muszą otrzymywać krew bez antygenów, do których skierowane są obecne u nich przeciwciała. Dawcy o takich fenotypach są trudno osiągalni. Według definicji wprowadzonej przez Międzynarodowe Towarzystwo Przetaczania Krwi ISBT do dawców rzadkiej grupy krwi zalicza się takich, których fenotyp występuje w populacji rzadziej niż 1/1000. ISBT rekomenduje, by w poszczególnych krajach tworzyć rejestry takich dawców oraz banki krwi od nich pobranej, na wypadek konieczności transfuzji u zimmunizowanego chorego. Każdy kraj powinien typować takich dawców i włączać się do tworzenia ogólnoświatowego rejestru. Zakres badań w poszczególnych krajach może być różny i powinien być ustalany na podstawie obserwacji wykrywania przeciwciał do antygenów powszechnych u chorych danego kraju. W Polsce badania swoistości przeciwciał do antygenów powszechnych wykonuje Pracownia Immunologii Krwinek Czerwonych ZIHiT; wydaje ona też zalecenia dotyczące doboru krwi dla takich chorych, których spełnienie sprawia trudności ze względu na brak odpowiednich dawców. Pracownia identyfikuje tego typu przeciwciała u 80-100 pacjentów rocznie. RCKiK-i w miarę możliwości przy pomocy surowicy immunizowanego chorego, wykonują w takich przypadkach badania członków rodziny, czy mieszkańców regionu, z którego pochodzi chory. Badania przy pomocy metod serologicznych mogą być jednak zastosowane w ograniczonym zakresie ze względu na brak komercyjnie dostępnych odczynników. Konieczne jest więc utworzenie w Polsce rejestru i banku krwi tych dawców, do którego włączy się dawców wytypowanych przy pomocy metod molekularnych. Muszą one być wykonywane przy pomocy metod o wysokiej przepustowości ze względu na konieczność przebadania dużej liczby dawców (od jednego do kilku tysięcy). System badań masowych oparty na zastosowaniu biorobotów opracowaliśmy ostatnio w ramach grantu PREVFNAIT. Opracowaliśmy go z myślą o perspektywicznych zastosowaniach dla masowych badań dawców w celu utworzenia rejestru dawców rzadkich grup. Przygotowując się do tych badań zamierzamy wystandaryzować w ciągu najbliższych dwóch lat metody oparte na technice real-time PCR do identyfikacji dawców bez antygenów powszechnie występujących: Kp(b), K0, LAN, Rh51, Co(a), Yt(a), Di(b), Jr(a-), Lu(b-), Wr(b) i innych, w miarę identyfikacji, przeciwciał u badanych chorych.

Hipoteza badawcza: Metody biologii molekularnej pozwolą na identyfikację dawców nie posiadających antygenów powszechnych, do których wykrywa się przeciwciała w Polsce. Wystandaryzowane metody będą mogły być użyte do utworzenia rejestru/banku dawców do celów transfuzjologicznych.

Plan realizacji projektu i metodyka: Na podstawie informacji o sekwencjach nukleotydów kodujących analizowane antygeny (głównie polimorfizmy SNP), zawarte w bazach danych www.ensembl.org/index.html, www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ zostaną zaprojektowane primery i sondy do wykonania badań techniką real-time PCR z sondami MGB. Standaryzacja metod będzie przeprowadzana przy użyciu DNA izolowanego od chorych bez antygenu powszechnego (unikalne próbki z zasobów pracowni konsultacyjnej) oraz kolejnych dawców krwi. Izolacja DNA i badania techniką real-time PCR będą prowadzone przy pomocy metod zautomatyzowanych z użyciem stacji pipetujących, tak, by można było oszacować koszty procedury badań w różnych skalach (96, 384) w celu przedstawienia oferty dla RCKiK, by móc wykonać je w odpowiednio liczebnej grupie polskich dawców krwi.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Opracowane metody zostaną zastosowane do masowych badań u krwiodawców wykonywanych przy pomocy metod w pełni zautomatyzowanych. Oferta wykonania badań zostanie przedstawiona decydentom w dziedzinie krwiodawstwa.

Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane.

Referencje:

1. Revelli N i wsp. The Lombardy Rare Donor Programme Blood Transfus. Jan 2014.

2. Hillyer CD, Shaz BH, Winkler AM, Reid M. Integrating molecular technologies for red blood cell typing and compatibility testing into blood centers and transfusion services. Transf. Med. Rev. 2008; 22: 117.

3. Meny GM, Flickinger C, Marcucci C The American Rare Donor Program J Crit Care. 2013 Feb;28(1):110.


Okres realizacji pracy: 3 lata.

Zadania do wykonania w 2015 r.: Zaprojektowanie primerów i sond oraz wykonanie badań dla 8 antygenów.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Raport

Wykonawcy: K. Guz, B. Michalewska, A. Orzińska, M. Pelc-Kłopotowska, H. Łopieńska, E. Brojer

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.4 2/004/2015

(PRACA NOWA)



Epidemiologia zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu E w Polsce

na podstawie analizy serologicznych i molekularnych markerów zakażenia

u dawców krwi – badania wstępne
Wstęp: HEV jest małym bezotoczkowym wirusem hepatotropowym. WZW typu E jest chorobą tzw. brudnych rąk, przenoszoną drogą pokarmową, ale udokumentowano także wiele przypadków przeniesienia zakażenia przez krew. Zazwyczaj zakażenie przebiega bezobjawowo, jednak u niektórych osób przebieg infekcji może mieć charakter ostry lub piorunujący prowadząc nawet do śmierci. Przypadki klinicznie ostrego przebiegu infekcji obserwowane są przede wszystkim u osób z obniżoną odpornością. Częstość występowania przeciwciał anty-HEV jest bardzo zróżnicowana w Europie i waha się wśród dawców krwi od 0,4% do 20,6%; w Japonii sięga 3,4%. Podobnie częstość aktywnego zakażenia stwierdzanego na podstawie obecności RNA wirusa w osoczu jest wysoka w różnych krajach. Przykładowo genom wirusa jest wykrywany nawet u kilku na 10.000 dawców. Dlatego uważa się, że w krajach takich jak Holandia czy Hiszpania niemal codziennie dochodzi do przetaczania zakażonych składników krwi. Ta poważna sytuacja epidemiologiczna sprawia, że w obecnej dyskusji przeważa opinia za wprowadzeniem badań NAT RNA HEV u dawców krwi. Trwa obecnie gromadzenie większej liczby obserwacji, które pomogą oszacować skalę ryzyka jakie niosą zakażone składniki krwi dla biorcy.

Co prawda, wiele wiadomo na temat sytuacji epidemiologicznej w krajach Europy zachodniej, to jednak nie dysponujemy żadnymi danymi dot. HEV w Polsce. [Stramer 2009, Juhl 2013, Baylis 2014, Slot 2013].



Hipoteza badawcza: Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu E może występować na terenie Polski i stanowić potencjalne zagrożenie dla bezpieczeństwa przetoczeń krwi. Potwierdzenie tej hipotezy będzie stanowić punkt wyjścia do określenia zasięgu geograficznego i skali epidemii w Polsce.

Cele badania: Ustalenie epidemiologii zakażeń HEV w populacji polskiej na podstawie badań przeciwciał anty-HEV oraz anty-WNV oraz materiału genetycznego wirusów u osób bez objawów (dawcy krwi). Dokonanie analizy występowania markerów zakażenia w różnych regionach kraju, grupach wiekowych.

Plan realizacji projektu i metodyka: W pierwszej kolejności badane będą swoiste przeciwciała w reprezentatywnej grupie pierwszorazowych dawców (po 100 próbek dla każdego z 21 RCKIK, w grupach wiekowych o takiej samej liczebności 19-29, 30-39, 40-49, 50-59 i ponad 60 lat), w przypadku uzyskania wyniku reaktywnego wykonane zostanie badanie RNA wirusa. W przypadku identyfikacji próbek zakażonych badanie polimorfizmu (analiza dostępnych próbek look back i follow-up, charakterystyka wirusologiczna: sekwencjonowanie, analiza ilościowa, analiza dostępnych danych klinicznych (morfologia, parametry biochemiczne itp.).

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Przeprowadzenie badań umożliwi ocenę aktualnej sytuacji epidemiologicznej HEV w Polsce i zagrożenia jakie możewirus stanowić dla bezpieczeństwa przetoczeń w naszym kraju. Ponieważ dotychczas nie publikowano danych dotyczących zakażeń HEV w Polsce, tego rodzaju analiza jest niezbędna do dyskusji ewentualnego rozszerzenia zakresu badań NAT u dawców o markery zakażenia wirusa zapalenia wątroby typu E.

Rodzaj pracy: Badanie naukowe stosowane.

Referencje:

Stramer SL, Hollinger FB, Katz LM, I wsp Emerging infectious disease agents and their potential threat to transfusion safety Transfusion 49, 2, 2009: 1S–29S,


Juhl D, Baylis SA, Blümel J, I wsp Seroprevalence and incidence of hepatitis E virus infection in German blood donors Transfusion 2014, 54, 1: 49-56.Baylis SA, Gärtner T, Nick S i wsp Occurrence of hepatitis E virus RNA in plasma donations from Sweden, Germany and the United States Vox Sanguinis 2012, 103, 1, 2012: 89–90.Slot E, Hogema BM, Riezebos-Brilman A, Kok TM, Molier M, Zaaijer HL. Silent hepatitis E virus infection in Dutch blood donors, 2011 to 2012. Eurosurveillance 2013, 18, 31: 23-29.
Okres realizacji pracy: 2015-2016.

Zadania do wykonania w 2015 r.: Zebranie próbek, wykonanie oznaczeń markerów serologicznych.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Raport, publikacja poglądowa.

Wykonawcy: P. Grabarczyk, M. Mikulska, E. Sulkowska, A. Kopacz, K. Tkaczuk,

M. Łętowska, R. Pogłód


KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.5 2/005/2015

(PRACA NOWA)



Przeglądowe badania czynników zakaźnych przenoszonych drogą krwi w Polsce - doskonalenie metodyki i analiza wyników
Wstęp: Co roku polska służba krwi pobiera ponad milion donacji od przeszło 300 tysięcy dawców. Przed każdym oddaniem krwi badane są markery serologiczne oraz kwasy nukleinowe wirusów zapalenia wątroby typu C (HCV), typu B (HBV), wirusa nabytego upośledzenia odporności (HIV), a także przeciwciała do Treponema Pallidum, u niektórych dawców dodatkowo badane jest DNA parvowirusa B19 (B19V). Dane pochodzące z badań przeglądowych w krwiodawstwie stanowią źródło najobszerniejszych informacji o sytuacji epidemiologicznej zakażeń wirusami przenoszonymi przez krew w grupie małego ryzyka. W trakcie badań przeglądowych identyfikuje się osoby, które zakażeniu uległy niedawno – dawców wielokrotnych oraz dawców zakażonych w tzw. „okienku serologicznym”. Zakład Wirusologii wykonuje także ocenę testów i urządzeń wykorzystywanych do prowadzenia badań przeglądowych u dawców oraz nadzoruje kontrolę jakości badań przeglądowych. W ostatnim czasie u dawców krwi obserwowana jest stabilizacja częstości markerów HBV mimo trwającego szerokiego programu szczepień przeciw WZW B i nieznaczny trend wzrostowy częstości zakażeń HCV. W przypadku HIV w latach 2007-2009 nastąpił blisko dwukrotny wzrost częstości zakażeń, obecnie sytuacja epidemiologiczna ustabilizowała się. Niepokojącym zjawiskiem jest przewaga wśród osób, u których wykryto zakażenie wielokrotnych dawców krwi.

Hipoteza badawcza: Przewaga dawców wielokrotnych wśród osób z wykrytym zakażeniem może wskazywać na występowanie zjawiska tzw. test seekers. Obecnie stosowana kwalifikacja dawców nie uwzględnia wszystkich aktualnych dróg szerzenia się zakażeń w Polsce. W przypadku wirusów HBV i HCV oraz Treponema Pallidum mamy do czynienia ze stabilizacją częstości zakażeń, choć w niektórych regionach można dostrzec trend wzrostowy. W populacji polskiej krążą mutanty ucieczki, nie obserwowane w dotychczasowych badaniach.

Cele badania: Analiza epidemiologiczna HCV, HBV, HIV, Treponema Pallidum oraz B19V ze szczególnym uwzględnieniem: dawców wielokrotnych i pierwszorazowych; poszczególnych regionów; zakażeń ostrych i przewlekłych. Ocena metod badań przeglądowych stosowanych w krwiodawstwie, w szczególności analiza czułości analitycznej i klinicznej.

Plan realizacji projektu i metodyka: Weryfikacja danych epidemiologicznych dotyczących wykrywania czynników zakaźnych w centrach krwiodawstwa: HCV (anty-HCV, RNA HCV), HBV (HBsAg, DNA HBV), HIV (anty-HIV, RNA HIV), B19V (DNA B19V), treponema pallidum (przeciwciała). Analiza danych statystycznych (częstości wyników powtarzalnie reaktywnych, wyników potwierdzonych, trendy w czasie, częstość w poszczególnych regionach itp.). Analiza źródeł zakażenia na podstawie ankiet epidemiologicznych wypełnionych przez osoby, u których wykryto zakażenie. Zgromadzenie danych do oceny ryzyka resztkowego (przede wszystkim dawcy zakażeni w okienku oraz dawcy wielokrotni). Uzupełnianie bazy dotyczącej „świeżych” zakażeń (dawcy zakażeni w okienku oraz dawcy wielokrotni) oraz zakażeń ukrytych HBV (OBI) – charakterystyka dawcy oraz charakterystyka wirusologiczna w szczególności analiza polimorfizmu). Badanie paneli rozcieńczeń materiału referencyjnego zawierającego określone stężenie markerów zakażenia oraz próbek od zakażonych dawców krwi (w miarę dostępności osocze zbadane testami ilościowymi, oceniony polimorfizm wirusa itp.).

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Ocena sytuacji epidemiologicznej oraz ocena czułości analitycznej i klinicznej badań przeglądowych posłuży do oszacowaniu ryzyka zakażenia czynnikami zakaźnymi przenoszonymi przez krew w Polsce z uwzględnieniem poszczególnych regionów, stosowanych strategii prowadzenia badań przesiewowych. Są to dane umożliwiające oszacowanie ryzyka powikłań wirusami przenoszonym przez krew w Polsce.

Rodzaj pracy: Badanie naukowe stosowane.

Referencje:

Łętowska M. [red] Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Rozdział 8 Diagnostyka czynników zakaźnych przenoszonych przez krew. Ewa Brojer, Maria Mikulska, Piotr Grabarczyk, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa 2011.

M. Mikulska, E. Sulkowska, E.Noceń, P. Grabarczyk, G. Liszewski, E. Brojer, M. Łętowska oraz Zespół ds. Wirusologicznych Badań Epidemiologicznych RCKiK Częstość zakażeń wirusem HIV wśród krwiodawców w Polsce w latach 2008-2010. XXIV Zjazd PTHiT, Lublin, 18-20 września 2011, Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Supp.: P-92.

Brojer E, Grabarczyk P, Liszewski G, Mikulska M, Allain J-P, Łętowska M, and the Polish Blood Transfusion Service Viral Study Group. Characterization of HBV DNA positive/HBsAg negative blood donors identified in the Polish NAT screening program. Hepatology 2006, 44(6): 1666-1674.

Brojer E, Gronowska A, Medyńska J, Grabarczyk P, Mikulska M, Łętowska M, Kryczka W, Gietka A. The HCV genotype frequency in HCV RNA positive/anti-HCV negative blood donors identified in NAT screening program in Poland. Transfusion 2004, 44(12): 1706-1710.

Brojer E, Grabarczyk P, Kopacz A, Liszewski G, Mikulska M, Magdalena L. Decade of viral nucleic acid testing (NAT) in Poland (2000–2010); methods and yields. The 21st Regional Congress of the ISBT, Europe - Lisbon, Portugal, June 18-22, 2011. Vox Sanguinis 2011, 101, 1 Supp. P-313.

Grabarczyk P, Garmiri P, Liszewski G, Doucet D, Sulkowska E, Brojer E, Allain J-P. and Polish Blood Transfusion Centers Viral Study Group. Molecular and serological characterization of hepatitis B virus genotype A and D infected blood donors in Poland. Journal of Viral Hepatitis 2010, 17: 444-452.

Grabarczyk P. Badanie polimorfizmu wirusów przenoszonych drogą krwi w Polsce — wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) oraz parvowirusa B19 (B19V). Journal of Transfusion Medicine 2011, tom 4, nr 2, 45–81.

Candotti D, Grabarczyk P, Ghiazza P, Roig R, Sauleda S, Ludicone P, Schmidt M, Bird A, Crookes R, Brojer E, Miceli M, Amiri A, Li Ch, Allain J-P. Epidemiology and molecular characterization of occult hepatitis B infection (OBI) in European asymptomatic blood donors. Journal of Hepatology 2008, 49(4): 537-547.

Grabarczyk P., Gdowska J., Liszewski G., Kopacz A., Piotrowski D., Górska J., Kuśmierczyk J, van Drimmelen H.,Lelie N., Lętowska M.,Brojer E. Head to head comparison of 1st and 2nd generation HBV/HCV/HIV-1 TMA blood screening assays. 31st International Congress of the ISBT in joint cooperation with the 43rd Congress of the DGTI, Berlin, Germany, June 26 – 1 July, 2010, Satelite symposium “Setting new standards in blood safety testing”.



Okres realizacji pracy: 2015.

Zadania do wykonania w 2015 r.: Statystyczna analiza danych. Analiza źródeł zakażenia na podstawie ankiet epidemiologicznych wypełnionych przez osoby zakażone. Zgromadzenie danych do oceny ryzyka resztkowego (przede wszystkim dawcy zakażeni w okienku oraz dawcy wielokrotni). Uzupełnianie bazy dotyczącej „świeżych” zakażeń (dawcy zakażeni w okienku oraz dawcy wielokrotni – charakterystyka dawcy oraz charakterystyka wirusologiczna).

Forma rozliczenia pracy w 2015 r: Publikacja oraz informacja na zjazd krajowy i międzynarodowy

Wykonawcy: P. Grabarczyk, A. Kopacz, E. Sulkowska, D. Kubicka-Russel, M. Mikulska, G. Liszewski, K. Tkaczuk, M. Łętowska, R. Pogłód
KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.6 2/006/2013

(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 2.9 w Planie Naukowym 2013

PRACA KONTYNUOWANA – Nr 2.8 w Planie Naukowym 2014)

Rejestr dawców krwi o homozygotycznych genotypach antygenów HPA płytek krwi oraz HNA granulocytów – niezbędne narzędzie diagnostyki serologicznej oraz zapewnienia bezpiecznej krwi chorym immunizowanym
Wstęp: Rejestr dawców krwi o określonych genotypach antygenów HNA granulocytów oraz HPA płytek krwi jest niezbędny do pracy laboratorium referencyjnego zajmującego się diagnostyką i badaniami naukowymi dotyczącymi powikłań poprzetoczeniowych przebiegających z dusznością (w tym TRALI) oraz alloimmunologicznych małopłytkowości i granulocytopenii. Służy też do celów transfuzjologicznych: koncentraty krwinek płytkowych od wyselekcjonowanych dawców przygotowuje się dla płodów i noworodków urodzonych przez kobiety z konfliktami płytkowymi w układzie HPA oraz dla chorych opornych na przetaczania KKP. Dla funkcjonowania rejestru konieczne jest oznaczanie antygenów HPA i HNA u kolejnych dawców regularnie oddających krew. Rejestr musi zawierać odpowiednio dużą liczbę dawców, szczególnie homozygot pod względem poszczególnych antygenów. Istnieje też konieczność uaktualniania rejestru o wyniki oznaczeń nowo poznawanych antygenów. Rejestr dawców utworzony w końcu lat 90-tych obecnie nie spełnia swojej roli, bo wielu dawców z antygenami o największej istotności klinicznej nie może już oddawać krwi ze względu na wiek lub stan zdrowia.

Hipoteza badawcza: Praca planowa ma charakter aplikacyjny – funkcjonowanie rejestru jest absolutnie niezbędne do prowadzenia wszelkich badań z dziedziny immunologii płytek i granulocytów.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Zgodnie z harmonogramem w roku 2013 zostanie wytypowanych 50 dawców. Ich dane zostaną włączenie do bazy KRDK wyników badań w klinicznie istotnych antygenach.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: Zgodnie z procedurami stosowanymi w krwiodawstwie – oznaczanie antygenów do celów transfuzjologicznych musi być wykonane z dwóch niezależnie pobranych próbek krwi. Ze względu na występowanie polimorfizmów w genach kodujących antygeny płytek, które mogą zaburzać wyniki konieczne jest wprowadzenie dodatkowej metody weryfikacji genotypowania. Planujemy rozszerzenie metodyki badania antygenów HPA o technologie LUMINEX oraz technikę MLPA.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Utworzony rejestr umożliwi prowadzenie badań diagnostycznych i naukowych w dziedzinie immunologii płytek i granulocytów. Będzie też służył do doboru płytek krwi dla chorych zimmunizowanych, opornych na przetoczenia KKP.

Rodzaj pracy: praca rozwojowa.

Referencje:

Arinsburg SA, Shaz BH, Westhoff C, Cushing MM. Determination of human platelet antigen typing by molecular methods: Importance in diagnosis and early treatment of neonatal alloimmune thrombocytopenia. Am J Hematol. 2012;87(5):525-8.

Berling P., Bux J., Curtis B. et al: Recommendation of the ISBT Working Party on Granulocyte Immunobiology for leucocyte antibody screening in the investigation and prevention of antibody mediated transfusion-related acute lung injury. Vox Sanguinis 2009;96:266-269.

Clay ME, Schuller RM, Bachowski GJ. Granulocyte serology: current concepts and clinical signifcance. Immunohematology 2010;26(1):11-21

dos Santos Bianchi JV, de Azevedo MRA, Eduardo Jens, Nukui Y, Chamone DAF. Frequency of human platelet antigens in oncohematological patients with thrombocytopenia and the probability of incompatibility to platelet transfusions Rev Bras Hematol Hemoter. 2012; 34(3): 202–205.

Ficko T., Galvani V., Rupreht R., Dovc T., Rozman P. Real-time PCR genotyping of human platelet alloantigens HPA-1, HPA-2, HPA-3 and HPA-5 is superior to the standard PCR-SSP method. Transfus Med 2004; 14: 425-32.

Jia-Yi Tan, Lay-Hoong Lian, Veera Sekaran Nadarajan. Genetic polymorphisms of human platelet antigens-1 to -6, and -15 in the Malaysian population. Blood Transfus. 2012; 10(3): 368–376.

Maślanka K, Uhrynowska M, Łopacz P, Guz K, Sak-Budzisz J, Wróbel A, Ostas A, Zupańska B, Brojer E. Incidence of leukocyte reacting antibodies in patients with dyspnea-associated non-hemolytic transfusion reactions and in the transfused blood components. P27. Journal Transf. Med. 2012, 5, 79

Maślanka K, Guz K, Uhrynowska M „ Rejestr dawców z oznaczonymi swoistymi antygenami płytek krwi (HPA) i jego zastosowanie w transfuzjologii.” Acta Haematol. Pol., 2005, 36, 189-196

Maślanka K., Apel D., Ceglarek B., Uhrynowska M., Dzieciątkowska A., Żupańska B. „Skuteczność przetoczeń koncentratów krwinek płytkowych u chorych zimmunizowanych.”- Acta Haemat. Pol., 2002, 33, 75-81.

Maślanka K., Uhrynowska M., Apel D., Ceglarek B., Dzieciątkowska A., Żupańska B. „Przydatność prób zgodności z użyciem limfocytów/płytek dawcy w przewidywaniu skuteczności przetaczanych krwinek płytkowych u chorych zimmunizowanych”. Acta Haematol. Pol. 2004, 35, 71-78.

Maślanka K., Żupańska B., Dębski R., Jakubowska M., Radomska I., Dzieciątkowska A. „Przetaczanie płytek krwi od dawców z oznaczonymi antygenami HPA w allommunologicznej małopłytkowości noworodków lub płodów.”- Acta Haemat. Pol., 1994, 25, 215-220.

Nielsen KR1, Koelbaek MD, Varming K, Baech J, Steffensen R. Frequencies of HNA-1, HNA-3, HNA-4, and HNA-5 in the Danish and Zambian populations determined using a novel TaqMan real time polymerase chain reaction method. Tissue Antigens. 2012 Sep;80(3):249-53.

Peterson JA, McFarland JG, Curtis BR, Aster RH. Neonatal alloimmune thrombocytopenia: pathogenesis, diagnosis and management. Br J Haematol. 2013; 161(1): 3–14.

Reil A, Wesche J, Greinacher A, Bux J. Geno- and phenotyping and immunogenicity of HNA-3. Transfusion. 2011;51(1):18-24.
Okres realizacji pracy: 1 rok.

Zadania do wykonania w 2015 r.: Wykonanie badań antygenów płytek i granulocytów u kolejnych dawców i ochotników. Badania będą prowadzone do momentu wytypowania przynajmniej trzech dawców o homozygotycznych genotypach.

Forma rozliczenia pracy w 2014 r.: Raport.

Wykonawcy: P. Łopacz, K. Guz, A. Orzińska, K. Maślanka, M. Uhrynowska

K
RN 15.12.2014 r.
ARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.7 2/007/2012

(PRACA NOWA – Nr 2.8 w Planie Naukowym 2012

PRACA KONTYNUOWANA – Nr 2.3 w Planie Naukowym 2013

PRACA KONTYNUOWANA – Nr 2.3 w Planie Naukowym 2014)



TRALI – udoskonalanie diagnostyki - doświadczenie własne
Wstęp: Ostra poprzetoczeniowa niewydolność płuc – TRALI (ang. Transfusion Related Acute Lung Injury) to wczesne, ciężkie powikłanie potransfuzyjne, którego podstawowym objawem jest obrzęk płuc. Może on wystąpić po przetoczeniu krwi pełnej i każdego ze składników krwi, jednak najczęściej występuje po przetoczeniu świeżo mrożonego osocza (FFP) i koncentratu krwinek płytkowych (KKP) - składnika bogatego w osocze. TRALI jest obecnie uważana za najczęstsze śmiertelne powikłanie poprzetoczeniowe - ok. 20% przypadków kończy się śmiercią chorego. Patogeneza tego zespołu jest złożona, ważną rolę odgrywają przeciwciała leukocytarne wykrywane w przetaczanych składnikach: aglutyniny anty-HNA-3a i anty-HLA-A2 oraz aktywujące monocyty krwi przeciwciała anty-HLA klasy II [1-6]. W mikrokrążeniu płucnym pobudzone neutrofilie niszczą śródbłonek naczyń powodując obrzęk. Od czasu opisania TRALI stale prowadzone są badania nad udoskonalaniem metod diagnostycznych i poznaniem patomechanizmu tego zespołu. Podkreśla się obecnie, że badania diagnostyczne w kierunku TRALI prowadzić należy stosując co najmniej trzy różne metody wykrywania i identyfikacji przeciwciał leukocytarnych. Duże nadzieje pokłada się w zastosowaniu technologii Luminex, która nie jest do tej pory stosowana w laboratorium referencyjnym IHiT.

Alloprzeciwciała skierowane do antygenów HNA-1, których nośnikiem jest specyficzny


dla neutrofili receptor FcRIIIb, mogą być przyczyną nie tylko poprzetoczeniowej reakcji TRALI ale też neutropenii noworodka w konfliktcie matczyno-płodowym.
Do niedawna wymieniano 3 alloantygeny HNA-1(-1a, -1b i -1c), warunkowane przez 3 allele genu FCGR3B, różniące się 6 SNP ze zmianą 5 aminokwasów w białku1,2,3]. Polimorfizm genu FCGR3B jest jednak bardziej skomplikowany - wykrywa się warianty alleli FCGR3B z przeciwstawnymi w/w SNP, zmieniającymi pojedynczy aminokwas. „Sztucznie skonstruowane” białka hybrydowe są różnie rozpoznawane przez przeciwciała anty-HNA-1a, -1b. Udowodniono, że epitop HNA-1a kształtuje Asn65Asp82 (277A, 277G), a epitop HNA-1b →Ser65Asn82 (227G, 277A). Ostatnio zaprezentowano przypadek przeczący dogmatowi obecności epitopu HNA-1b u osoby z genotypem FCGR3B*01,*03, ponieważ wytworzyła ona przeciwciała anty-HNA-1b. Rozpoznano u niej nowy antygen HNA-1d, którego epitop kształtuje Ala78Asn82. Dodatkową zmienność genu FCGR3B wprowadza możliwość jego duplikacji lub delecji. Gen FCGR3B jest też wysoce homologiczny do genu FCGR3A, który ulega ekspresji na komórkach NK, makrofagach i monocytach, a różni się od FCGR3B dodatkowymi 6 mutacjami i ma mieszaną sekwencję w SNP różniących allele FCGR3B*01 i *02. Białko FcRIIIa nie jest rozpoznawane przez przeciwciała anty-HNA-1a ani anty-HNA-1b[1,2,3].

Wykrywanie alleli FCGRB3 opiera się na metodzie PCR-SSP[3,11]. Badanie fenotypu HNA-1 wykonuje się techniką MAIPA i/lub GIFT ze swoistymi surowicami anty-HNA-1.

W obecnej pracy chcemy zbadać przyczynę różnicy wyników fenotypowania i genotypowania antygenu HNA-1a u dawcy preparatu KKCz, którego przetoczenie wywołało TRALI. U chorej wykryto przeciwciała anty-HNA-1a, a trzej poprzedni dawcy KKCz byli serologicznie i genetycznie HNA-1a(+), ale reakcja TRALI nie wystąpiła. Wstępne allelospecyficzne sekwencjonowanie cDNA z mRNA granulocytów wykazało brak nukleotydu 227A, co tłumaczy ujemny wynik oznaczania allelu FCGR3B*01. Wyniki te sugerują obecność u dawcy 2 wariantów FCGR3B (GCGCAA i GCGAAA) obok allelu FCGR3B*02 (CTGCAA) i *03 (CTGAAA)[12]. Być może któryś z tych wariantów jest rozpoznawany przez surowicę anty-HNA-1a, mimo że oba nie mają motywu Asn65Asp82 (227A, 277G), uważanego za kształtowanie epitopu antygenu HNA-1a.

Hipoteza badawcza: Analizy retrospektywne pozwolą na określenie ryzyka występowania i przedstawią wyniki diagnostyki TRALI w Polsce. Analiza wyników z różnych regionów kraju, pozwoli na ustalenie czy TRALI jest właściwie diagnozowane w Polsce. Przewidujemy, że zastosowanie technologii Luminex udoskonali diagnostykę. Dodatkowo stawiamy hipotezę, że obecne u dawcy warianty FCGRB z Arg36, tworzą częściowy epitop HNA-1a, rozpoznawany przez przeciwciała anty-HNA-1a.

Dla weryfikacji powyższej hipotezy konieczne jest -

1. Wykluczenie bądź dowiedzenie obecności innych niż anty-HNA-1a przeciwciał u chorej.
2. Ilościowe badania ekspresji antygenu HNA-1a na granulocytach dawcy (MAIGA, GIFT) w porównaniu z innymi dawcami homo/heterozygotycznymi pod względem HNA-1a(+).

3. Analiza DNA i mRNA z granulocytów dawcy (CD15+), którego KKCz wywołało TRALI: a) sekwencjonowanie całej sekwencji ORF receptora FcRIIIb, b) wykluczenie kontaminacji przez mRNA receptora FcRIIIa z innych komórek (np. komórek NK CD56+), c) modelowanie cząsteczek wariantów allelicznych receptora FcRIIIb d) ocena dozy genu/alleli FCGR3B.

4. Analiza dziedziczenia alleli FCGR3B w rodzinie dawcy, którego KKCz wywołało TRALI.

5. Analiza występowania alleli/wariantów FCGR3B wraz z określeniem ich dozy w populacji Polskiej (zarchiwizowane DNA od ~300 osób z oznaczonymi genotypami HNA-1).


Dotychczasowa realizacja celów badania: Oceniono częstość, objawy kliniczne i występowanie przeciwciał leukocytarnych w odczynach niehemolitycznych przebiegających z dusznością, w latach 2007-2011. W 2012 roku diagnozowano kolejnych 7 odczynów z dusznością. W wybranych przypadkach wykonano badania przeciwciał anty HLA w Luminexie. Przebadano 82 surowice dawców z zastosowaniem systemu LUMINEX.
Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu wraz z uzasadnieniem: 1. Badania serologiczne (MAIGA, GIFT) dla weryfikacji swoistości przeciwciał anty HNA-1 u chorej i oceny ekspresji antygenu HNA-1a u dawcy KKCz/dawców panelowych. 2. Sekwencjonowanie FCGR3B z komórek CD15(+) i FCGR3A z komórek CD56(+) u dawcy KKCz (z DNA i mRNA). 3. Analiza dozy genu/alleli FCGR3B u dawcy KKCz, jego rodziny i u 300 osób (RQ PCR)
Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:

1) Określenie częstości występowania i przedstawienie wyników diagnostyki TRALI


w Polsce.

2) Udoskonalenie diagnostyki poprzez zastosowanie technologii Luminex.

3) Wprowadzenie odpowiednich zaleceń dotyczących postępowania z dawcami i biorcami
krwi w celu zapobiegania występowania TRALI.

4) Rozpropagowanie rozpoznawania TRALI w Polsce.

5) Określenie częstości występowania alleli SLC44A2 * 1( fenotyp HNA-3a) i SLC44A2 * 2
(fenotyp HNA-3b) u dawców krwi i biorców z niehemolitycznymi objawami poprzetoczeniowymi.

6) Weryfikacja naukowej hipotezy o budowie epitopu HNA-1a na granulocytach;

7) Ustalenie, jakie primery powinny być używane, poza dotychczas stosowanymi, do identyfikacji opisanych wariantów FCGR3B.
Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane/praca rozwojowa.
Referencje:

1. Bux J.: Antibody-mediated (immune) transfusion-related acute lung injury.

Vox Sanguinis 2011;100:122-128.

2. Berling P., Bux J., Curtis B. et al: Recommendation of the ISBT Working Party on Bux J.: Antibody-mediated (immune) transfusion-related acute lung injury. Vox Sanguinis 2011;100:122-128.

3. Berling P., Bux J., Curtis B. et al: Recommendation of the ISBT Working Party on Granulocyte Immunobiology for leucocyte antibody screening in the investigation and prevention of antibody mediated transfusion-related acute lung injury. Vox Sanguinis 2009;96:266-269.

4. Silliman Ch.C., Fung Y.L., Bail B., Khan S.: Transfusion-related acute lung injury (TRALI): Current concepts and misconceptions. Blood Reviews 2009;23:245-255.

5. Sachs U.J.H., Wasel W., Behmaz R. et al: Mechnism oftransfussion-related acute lung injury induced by HLA class II antibodies. Blood 2011;117(2):669-677.

6. Toy P., Popovsky M.A., Abraham E. et al: Transfusion-related acute lung injury: Definition and review. Crit Care Med 2005;33:721-726.

7. Wallis J.P. Progress in TRALI. Transfusion Medicine 2008;18:273-275

8. Żupańska B., Uhrynowska M., Michur H. et al.: Transfusion-related lung injury and leucocyte-reacting antibodies. Vox Sang. 2007;93:70-77.

9. ŻupańskaB., Uhrynowska M., Maślanka K. et al.: Potransfuzyjna ostra niewydolność oddechowa-groźne zbyt rzadko rozpoznawane powikłanie poprzetoczeniowe. Pol. Merk. Lek., 2006,XX, 119, 514-518

10. Uhrynowska M., Szczepanik AB., Konopka L. et al.: Potransfuzyjna ostra niewydolność oddechowa – trudności diagnostyczne. Acta Haemat.Pol. 2003,34,507-512.

11. Żupańska B., Uhrynowska M., Konopka L. Transfusion-related acute lung injury due to granulocyte-agglutingnation antibody in a patient with paroxysmal nocturial hemoglobinuria. Transfusion.1999,39,944-947.

12. Maślanka K., Michur H., Żupańska B. et al. : Leukocyte antibodies In blond donors and a look back on recipients of their blond components. Vox Sang 2007 Apr 92(3) 247-249.

13. Flesch BK, Reil A, Bux J. Genetic variation of the HNA-3a encoding gene. Transfusion. 2011;51(11):2391-7

Reil A, Wesche J, Greinacher A, Bux J. Geno- and phenotyping and immunogenicity of HNA-3. Transfusion. 2011;51(1):18-24.

14. Greinacher A, Wesche J, Hammer E, Fürll B, Völker U, Reil A, Bux J. Characterization of the human neutrophil alloantigen-3a. Nat Med. 2010;16(1):45-8.

15. Clay M.E., Schuller R.M., Bachowski G.J.: Granulocyte serology: current concepts and clinical signifcance. Immunohematology 2010; 26(1): 11-21

16. Ory P.A., Clark M.R., Kwoh E.E. i wsp.: Sequences of complementary DNAs that encode the NA1 and NA2 forms of Fc receptor III on human neutrophils. J. Clin. Invest. 1989; 84(5): 1688-91.

17. Bux J., Stein E.L., Bierling P. i wsp.: Characterization of a new alloantigen (SH) on the human neutrophil Fc gamma receptor IIIb. Blood 1997; 89(3): 1027-34.

18. Terzian C.C., Chiba A.K., Santos V.C. i wsp.: FCGR3B*03 allele inheritance pattern in Brazilian families and some new variants of gene FCGR3B. Transfusion 2012;52(3):629-34.

19. Bauer C, de Haas M, Bein G i wsp. A detailed mapping of HNA-1a and HNA-1b epitopes of FcgammarIIIb. Vox Sang. 2010; 99 (Suppl.2): 35.

20. Reil A., Sachs U.J., Berghoefer H., Bux J.: HNA-1d – a new epitope located on Fc gamma Receptor IIIb (FcRIIIb). J. Transf. Med. 2012; 5(2): 647.

21. Niederer H.A., Willcocks L.C., Rayner T.F. i wsp. Copy number, linkage disequilibrium and disease association in the FCGR locus. Hum. Mol. Genet. 2010; 19(16): 3282-94.

22. Guz K., Brojer E., Zupanska B.: Implications of NA1/NA2 and SH genotyping results in the Polish population with regard to the new nomenclature of granulocyte alloantigens. Transfusion 2000; 40(4): 490-1.

23. Maślanka K., Guz K., Uhrynowska M., Żupańska B.: Isoimmune neonatal neutropenia due to anti-Fc(gamma) RIIIb antibody in a mother with an Fc(gamma) RIIIb deficiency. Transf. Med. 2001; 11(2): 111-3.

24. Bux J., Stein E.L., Santoso S., Mueller-Eckhardt C.: NA gene frequencies in the German population, determined by polymerase chain reaction with sequence-specific primers. Transfusion 1995; 35(1): 54-7.

Uhrynowska M., Maślanka K., Guz K., Łopacz P., Milewska J., Brojer E.: Przypadek poprzetoczeniowej ostrej niewydolności oddechowej spowodowanej swoistymi przeciwciałami przeciwgranulocytarnymi – trudności diagnostyczne. Acta Haemat. Pol. 2011, 42, 3, 593-596.

25. Guz K., Maślanka K., Skulimowska J. i wsp.: Genotype/phenotype discrepancy of HNA-1a antygen typing In blond donor involved In TRALI Leeds to the indentification of FCGR3B wariant. J. Transf. Med. 2012; 5(2): 83.
Pozostały okres realizacji pracy: 1 rok.

Zadania do wykonania w 2014 i 2015 r.: Badania przeciwciał anty HLA w przesyłanych do

zdiagnozowania przypadkach w testach LCT i ELISA oraz z zastosowaniem techniki

LUMINEX. Separacja komórek CD15+ i CD56+ od dawcy (który wywołał TRALI) celem:

- badania ekspresji antygenów HNA-1 (MAIGA/GIFT);

- izolacji DNA; mRNA  syntezy cDNA i sekwencjonowania genu FCGR3B oraz   

FCGR3A z w/w frakcji;

- opracowania metody do oceny dozy genu FCGR3B. Opracowanie wyników, napisanie

pracy.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Praca przygotowana do druku / publikacja
Wykonawcy: M. Uhrynowska, K. Maślanka, M. Łętowska, P. Łopacz, K. Guz, A. Orzińska, A. Wróbel, A. Rosiek, E. Brojer, P. Baran, J. Skulimowska

K
RN 15.12.2014 r.
ARTA PRACY PLANOWEJ Nr 2.8 2/006/2012

(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 2.2 w Planie Naukowym 2013



PRACA KONTYNUOWANA – Nr 2.2 w Planie Naukowym 2014)
Badania molekularne odmian antygenów układu AB0 i innych antygenów

grup krwi w Polsce
Wstęp: Układ AB0 jest najważniejszym wyznacznikiem zgodności w klinicznej transfuzjologii medycznej. Wykonywane powszechnie u wszystkich biorców krwi badania grup krwi AB0 oparte są, od początku ich odkrycia, na tych samych zasadach serologicznych, polegających na określaniu antygenów A lub/ i B na krwinkach czerwonych oraz jednocześnie na wykazaniu w surowicy odpowiednio obecności lub braku przeciwciał regularnych anty-A lub/i anty-B. Stwierdzono, że oprócz typowych reakcji wskazujących na grupę A, B, 0, lub AB w rzadkich przypadkach otrzymuje się reakcje, które nie pozwalają jednoznacznie na określenie grupy AB0. Ustalono, że wśród antygenów zarówno A jak i B występuje szereg słabych odmian, które w obecnym stanie wiedzy i możliwościach technologicznych są charakteryzowane metodami biologii molekularnej przez analizę genu znajdującego się na chromosomie 9, kodującego enzym glikozylotransferazy, który przyłącza 1,2 N-acetyl-D-galaktozaminę (determinantę antygenu A) lub D-galaktozę (determinantę antygenu B) lub obie, do łańcucha oligosacharydowego znajdującego się na glikoproteinach lub glikolipidach krwinki czerwonej. Badania molekularne muszą również uwzględniać analizę genów FUT1 i FUT2 na chromosomie 17 kodujących enzym fukozylotransferazę, który dołącza do prekursorowego łańcucha oligosachrydowego L-fukozę i determinuje ekspresję antygenu H. Jest on niezbędny dla powstania determinant antygenów A i B.
Hipoteza badawcza: Podłożem obserwowanych reakcji serologicznych wskazujących na słabe odmiany antygenów A i B są mutacje w allelach AB0. Prowadzą one do zmian sekwencji aminokwasów w enzymach transferazy N-acetylogalaktozaminy lub transferazy D-galaktozy. Na wystąpienie słabej ekspresji antygenówA i B wpływa również występowania określonego wariantu allelu 0, który może wzmagać lub osłabiać ekspresję tych antygenów (np. wpływ 02 i 01v w odmianie Ax).
Dotychczasowa realizacja celów badania: Wykryte u 2 osób i scharakteryzowane serologicznie fenotypy 0h Bombay zostały scharakteryzowane metodami molekularnymi. Przygotowano pracę do druku.
Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu wraz z uzasadnieniem: Plan na 2014 wymaga rozszerzenia zakresu badań molekularnych; zastosowane testy PCR SSP nie różnicują odmian, które zostały wykryte. Konieczne jest też dalsze rozszerzenia panelu testów serologicznych. Pozostaje konieczność zakupu wirówki do testów mikrokolumnowych. Wiąże się to z koniecznością zwiększenia budżetu projektu do sumy 32 000 zł. Dodatkowo jest konieczność zakupu wirówki (była w planie na 2013 r.).
Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Uzyskane wyniki będą miały wartości poznawcze i uzupełnią wiedzę o podłożu molekularnym grup krwi. W literaturze podkreśla się, że badania takie muszą dotyczyć populacji w różnych krajach. W Polsce ze względu na jej położenie geograficzne i wpływy zachodzących w przeszłości migracji ludności o pochodzeniu azjatyckim obserwuje się odstępstwa w częstości antygenów, a być może w ich podłożu genetycznym, w porównaniu z populacją Europy Zachodniej. Znaczenie praktyczne gromadzenia tego rodzaju wyników jest znaczące, ze względu na rozważane przez ekspertów w dziedzinie immunologii transfuzjologicznej uzupełnienie badań serologicznych grup krwi badaniami molekularnymi. Konieczne jest zweryfikowanie opinii wygłaszanej przez niektórych ekspertów, że w przyszłości badania serologiczne będzie można zastąpić badaniami molekularnymi. Oceniono, że ryzyko uzyskiwania niewielkiego odsetka fałszywych wyników w obu typach badań jest porównywalne. Istotne jest też znaczenie edukacyjne projektu.
Referencje:

1. Yamamoto F., Clausem H., White T., Marken N., Hakomori S.: Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature 1990; 345: 229-233.

2. Blood Group Antigen Gene Mutation Database - strona internetowa www.ncbi.nlm.nih.gov

3. Seyfried H., Walewska I., Werblińska B.: Unusual inheritance of ABO group in a family with weak B antigens. Vox Sang. 1964; 9: 268–277.

4. Olsson M.L., Michalewska B., Hellberg A., Walaszczyk A., Chester M.A.: A clue to the basis of allelic enhancement: occurrence of the Ax subgroup in the offspring of blood group O parents. Transfus Med. 2005; 15: 435-442.
Pozostały okres realizacji pracy: 1 rok.

Zadania do wykonania w 2015 r.: Przygotowywanie i prezentowanie doniesień zjazdowych – PTHiT Szczecin, ISBT Londyn.

Forma rozliczenia pracy w 2015 r.: Doniesienia zjazdowe.

Wykonawcy: B. Michalewska, H. Łopieńska, K. Guz, M. Krzemieniowska lub P. Baran, E. Brojer

Temat 3 „Komórkowe



i molekularne składniki krwi

w stanach zdrowia i choroby”


Pobieranie 484.32 Kb.

Share with your friends:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   17




©operacji.org 2020
wyślij wiadomość

    Strona główna