WłAŚciwości fizyko-chemiczne wód nastoinowych I cytometria przepływowa w ocenie żywotności I wigoru nasion


ROLA CENTRALNYCH I OBWODOWYCH NARZĄDÓW LIMFATYCZNYCH W POWSTAWANIU RADIALNEJ SEGMENTACJI (RS) JĄDER ORAZ KSZTAŁTOWANIU AKTYWNOŚCI FOSFATAZY KWAŚNEJ W LIMFOCYTACH KRWI KURCZĄT IMMUNIZOWANYCH



Pobieranie 339,15 Kb.
Strona2/4
Data25.02.2018
Rozmiar339,15 Kb.
1   2   3   4

ROLA CENTRALNYCH I OBWODOWYCH NARZĄDÓW LIMFATYCZNYCH W POWSTAWANIU RADIALNEJ SEGMENTACJI (RS) JĄDER ORAZ KSZTAŁTOWANIU AKTYWNOŚCI FOSFATAZY KWAŚNEJ
W LIMFOCYTACH KRWI KURCZĄT IMMUNIZOWANYCH


Aleksandra Pliszczak-Król

Streszczenie. Oceniano zdolność tworzenia radialnej segmentacji jąder (RS) oraz aktywność fosfatazy kwaśnej (Fk) w limfocytach krwi kurcząt, którym operacyjnie usunięto centralne (grasicę, torbę Fabrycjusza) lub obwodowe (śledzionę) narządy limfatyczne. Kurczęta te w 6 tygodniu życia dodatkowo immunizowano LPS lub SRBC. Zabiegi usunięcia centralnych narządów (tymektomię i bursektomię) przeprowadzono w 1 dobie
życia kurcząt. Splenektomii (zabiegowi usunięcia śledziony) poddano kurczęta
3-tygodniowe. Materiał do badań stanowiła krew pobrana od kurcząt doświadczalnych w 6 dniu po stymulacji antygenowej. Wykonano test spontanicznej i indukowanej radialnej segmentacji jąder oraz cytochemiczne oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej w limfocytach pobranej krwi. Wykazano, że u kurcząt operowanych, poddanych immunizacji zdolność tworzenia RS oraz aktywność Fk w limfocytach są zróżnicowane. Uzależnione jest to od rodzaju wykonanego zabiegu operacyjnego oraz w pewnym stopniu – od rodzaju antygenu użytego do stymulacji. Zmieniona zdolność tworzenia jąder segmentowanych oraz zmiany aktywności fosfatazy kwaśnej są prawdopodobnie skutkiem defektu funkcjonalnego i zaburzeń kooperacji limfocytów, spowodowanych brakiem oddziaływania narządów limfatycznych. Stwierdzono też, że istotny wpływ na RS i aktywność Fk wywiera stan układu immunologicznego ptaków doświadczalnych w momencie immunizacji.

Słowa kluczowe: limfocyty, bursektomia, tymektomia, splenektomia, radialna segmentacja, fosfataza kwaśna, antygeny, LPS, SRBC

Wstęp


W układzie limfatycznym kręgowców podstawową rolę pełnią limfocyty. Komórki te dojrzewają w centralnych narządach limfatycznych, a następnie migrują i zasiedlają odpowiednio: strefy grasiczozależne (limfocyty T) i strefy grasiczoniezależne (limfocyty B) narządów limfatycznych obwodowych. Obecność w narządach limfatycznych obu populacji limfocytów, jak również makrofagów i komórek dendrytycznych zapewnia funkcjonowanie i optymalną kooperację wszystkich komórek, co jest niezbędnym warunkiem zainicjowania rozwoju i przebiegu odpowiedzi immunologicznej [Graczyk 1994, Graczyk i Kuryszko 1995, Madej i Graczyk 1997].

Reaktywność komórek układu immunologicznego zależy od rozwoju i stanu funkcjonalnego narządów limfatycznych [Graczyk 1994, Graczyk 1998, Graczyk i Kuryszko 1995, Graczyk i in. 1998, Marsh 1993, Paramithiotis i Ratcliffe 1994]. W centralnych narządach limfatycznych (CNL) prekursory limfocytów nabierają odmiennych właściwości – zyskują swoiste piętno, które decyduje o ich dalszym losie [Glick 1995, Graczyk 1985, Hirota i Bito 1975, Madej i Graczyk 1997, Marsh 1993, Paramithiotis i Ratcliffe 1994, Radziszewska 1995]. Obwodowe narządy limfatyczne (ONL) są miejscem interakcji z antygenem, aktywacji, proliferacji, dojrzewania i śmierci limfocytów [Graczyk 1994].

Wśród wielkiej i zróżnicowanej ewolucyjnie grupy zwierząt, jakimi są kręgowce, bardzo interesującą grupę, biorąc pod uwagę budowę układu limfatycznego, stanowią ptaki. W odróżnieniu od ssaków, u ptaków miejscem dojrzewania limfocytów B, jest workowaty uchyłek kloaki nazwany torbą Fabrycjusza [Glick 1995, Madej i Graczyk 1997, Paramithiotis i Ratcliffe 1994]. Wykazano, że pozbawienie ptaków torby Fabrycjusza prowadzi do upośledzenia a nawet zahamowania produkcji przeciwciał [Graczyk 1985, Hirota i Bito 1975], przy nieznacznym wpływie na odporność typu komórkowego [Madej i Graczyk 1997]. Stopień upośledzenia odpowiedzi humoralnej po bursektomii zależy od czasu i techniki przeprowadzenia tego zabiegu [Hirota i Bito 1975]. Z kolei po usunięciu grasicy dochodzi do osłabienia lub zniesienia odpowiedzi typu komórkowego [Graczyk i Kuryszko 1995, Madej i Graczyk 1997, Marsh 1993], bez wyraźnych zmian w zakresie odporności humoralnej, co próbuje się tłumaczyć zaburzeniem kooperacji limfocytów [Madej i Graczyk 1997].

U większości gatunków ptaków, pozbawionych węzłów chłonnych, rolę obwodowego narządu limfatycznego pełni miazga biała śledziony [Graczyk i in. 1998]. To w tym narządzie, szczególnie po dożylnym podaniu antygenu, ma miejsce klonalna proliferacja i selekcja komórek produkujących przeciwciała o wysokim powinowactwie do antygenu [Graczyk i in. 1998]. We wcześniejszych badaniach własnych stwierdzono, że po usunięciu śledziony (splenektomii) dochodzi do upośledzenia syntezy przeciwciał. Nie notowano przy tym zmian w przebiegu odpowiedzi typu komórkowego. Wykazano natomiast, że u kurcząt splenektomowanych dochodzi do zmian proliferacyjnych oraz pobudzenia komórek w grasicy i torbie Fabrycjusza, które jednak nie rekompensują braku śledziony [Graczyk i in. 1998]. Te i inne spostrzeżenia wskazują na istnienie wzajemnych i dwustronnych zależności pomiędzy centralnymi i obwodowymi narządami limfatycznymi [Graczyk 1985, Graczyk i Kuryszko 1995, Graczyk i in. 1998, Heller i Perek 1973].

Przebieg i charakter odpowiedzi immunologicznej warunkowane są stopniem dojrzałości limfocytów oraz ich zdolnością do rozpoznawania i reagowania na antygeny – substancje traktowane przez ustrój jako „obce” [Madej i Graczyk 1997]. Z dojrzewaniem limfocytów i ich zaangażowaniem w procesach immunologicznych związane są zmiany w morfologii i w wyposażeniu enzymatycznym tych komórek. W szczególności dotyczą one enzymów aparatu lizosomalnego [Graczyk 1985, Graczyk 1998, Graczyk i Kuryszko 1995]. Do enzymów lizosomalnych zaliczana jest m.in. fosfataza kwaśna (Fk), uznawana za marker tych struktur komórkowych [Graczyk 1985, Graczyk 1994]. Jej rola biologiczna w limfocytach nie jest ostatecznie wyjaśniona. Zmiany aktywności Fk stwierdzono w trakcie dojrzewania układu immunologicznego oraz w przebiegu transformacji blastycznej limfocytów [Graczyk 1994, Graczyk 1998]. Pojawiają się one także w odpowiedzi na stymulujące działanie antygenów [Graczyk 1994, Graczyk 1998]. Zmiany aktywności fosfatazy kwaśnej obserwowano w przewlekłej białaczce limfatycznej, w chorobach alergicznych oraz przy osłabieniu mechanizmów odpornościowych u osobników starszych [Graczyk 1994, Graczyk 1998]. Przyjęto, że oznaczanie aktywności Fk może być wskaźnikiem wzrostu i dojrzałości układu immunologicznego oraz odzwierciedleniem stanu czynnościowego limfocytów [Graczyk 1985, Graczyk 1998, Graczyk i Kuryszko 1995].

Zmiany w limfocytach, pojawiające się w wyniku oddziaływania różnych czynników zewnętrznych i wewnętrznych, wiążą się nie tylko ze zmianami enzymatycznymi. Może towarzyszyć im reorganizacja pozostałych struktur komórkowych, w tym także cytoszkieletu [Anand i Iih Nan Chou 1993, Ostrowski 1995]. Cytoszkielet stanowi trójwymiarową sieć, występującą w komórkach eukariotycznych, utworzoną z elementów włóknistych: mikrotubul, filamentów pośrednich i mikrofilamentów [Czyż 1995, Jagła i in. 1991]. Okazuje się, że nie jest on strukturą statyczną, nadającą jedynie odpowiedni kształt komórce [Czyż 1995]. Może ulegać ciągłej, dynamicznej reorganizacji [Ding i in. 1995, Mandelkow i in. 1991]. Odpowiednia organizacja przestrzenna włókien cytoszkieletu umożliwia zdolność adhezji do podłoża, co jest komórce niezbędne do wzrostu i różnicowania [Czyż 1995, Jagła i in. 1991, Ostrowski 1995, Pardi i in. 1992]. Poszczególne włókna, m.in. mikrotubule biorą udział w przewodzeniu informacji z błony komórkowej do jądra (transdukcja sygnału mitotycznego) i indukcji odpowiedzi biochemicznej (indukcja syntezy DNA i białek) [Anand i Iih Nan Chou 1993, Czyż 1995, Jagła i in. 1991, Mandelkow i in. 1991, Ostrowski 1995, Pardi i in. 1992, Radziszewska 1995]. Mikrofilamenty pośrednio koordynują reakcje enzymatyczne, zapewniając odpowiednią kompartmentację enzymów, m.in. glikolitycznych, przez co mają wpływ na regulację glikolizy i procesów energetycznych [Czyż 1995]. Mikrotubule natomiast uczestniczą w transporcie enzymów między poszczególnymi przedziałami oraz w transporcie enzymów lizosomalnych [Czyż 1995, Kreis 1990]. Mikrofilamenty w połączeniu z odpowiednimi białkami (żelzoliną, wiliną, kalmoduliną) zmieniają stopień żelifikacji cytoplazmy, co jest istotne dla przebiegu procesów biochemicznych w komórce [Czyż 1995]. Architektura cytoszkieletu decyduje o organizacji cytoplazmy komórkowej [Czyż 1995, Ding i in. 1995]. Białka budujące elementy włókniste cytoszkieletu mają zdolność integracji z organellami komórkowymi: mitochondriami, lizosomami, retikulum endoplazmatycznym, aparatem Golgiego [Czyż 1995, Kreis 1990, Morris i Hollenbeck 1995].



O udziale cytoszkieletu w procesach metabolicznych świadczy fakt występowania zmian w budowie i organizacji jego struktur obserwowany w komórkach w różnych procesach patologicznych (np. nowotwory, mononukleoza zakaźna, cukrzyca) [Anand i Iih Nan Chou 1993, Ding i in. 1995, Jagła i in. 1991]. Knox i in. [1993] badając wpływ taxolu i hipertermii na procesy polaryzacji cytotoksycznych limfocytów T zauważyli, że w komórkach tych utrata i odtworzenie przestrzennej organizacji mikrotubul przebiega równolegle z utratą i odzyskaniem aktywności cytolitycznej. Mikrotubule nie są elementami stabilnymi [Mandelkow i in. 1991]. Wykazują niezwykłą właściwość ciągłej zmiany swej długości wskutek fazowo przebiegających procesów polimeryzacji i depolimeryzacji [Ding i in. 1995, Mandelkow i in. 1991]. Stan tej dynamicznej „niestabilności” jest stwierdzany nawet przy stałych warunkach, zarówno in vivo, jak i in vitro [Mandelkow i in. 1991].

Ze zwiększoną depolimeryzacją mikrotubul związane jest występowanie głębokich szczelin w jądrze komórek jednojądrzastych krwi obwodowej człowieka i zwierząt. Szczeliny te, zbiegając się koncentrycznie w centrum komórki, dzielą jądro na kilka płatów i upodabniają je do np. ósemki lub liścia koniczyny (rys. 1) [Inoue 1988, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973, Simmingsköld i in. 1981, Valmin 1976].

Rys. 1. Limfocyt wykazujący radialną segmentację – schemat za Norbergiem, w modyfikacji własnej. Objaśnienia: a – płat jądra, b – szczeliny międzysegmentalne, c – wiązka mikrotubuli opasujących jądro, d – centriola

Fig . 1. Lymphocyt with radial segmentation of nuclei – Norberg’s scheme in own modification. Explanations: a – the nuclear lobe, b – the intersegmental clefts, c – the bundle of microtubules encircling the nucleus, d – the centriole


Söderström, Norberg i in. zjawisko to nazwali radialną segmentacją jąder (RS) [Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967, Starzyńska i Kieszek 1988]. Tego rodzaju „deformację” jądra obserwowano w limfocytach białaczkowych, w innych komórkach nowotworowych, w limfocytach i monocytach napromieniowanych lub zainfekowanych wirusami, w limfocytach osób chorych na mononukleozę zakaźną [Cawley 1972, Graczyk i in. 1998, Inoue 1988, Ito 1974, Neftel i in. 1983, Norberg 1969, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973, Simmingsköld i in. 1981, Valmin 1976]. Okazało się, że zjawisko radialnej segmentacji jąder limfocytów może pojawiać się spontanicznie. Można je też indukować in vitro inkubując krew w środowisku zawierającym antykoagulanty, szczególnie wiążące jony Ca+2, np. szczawiany. Przy czym zdolność limfocytów do tworzenia indukownej chemicznie RS okazuje się zależeć od wielu czynników, a mechanizm jej powstawania jest złożony [Borucka-Sztobryn 1985, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Ito 1974, Norberg 1969, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967, Pliszczak-Król i Graczyk 1995, Starzyńska i Kieszek 1988].

Początkowo sugerowano, iż RS jest efektem zaburzonej mitozy lub amitozy [Borucka-Sztobryn 1985, Ito 1974, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Söderström 1967], podczas których dochodzi do przedwczesnego i niepełnego podziału jądra [Norberg i Söderström 1967]. Późniejsze badania wykazały jednak, że w komórkach z RS


błona jądrowa i nukleoplazma są nienaruszone [Norberg i Söderström 1967]. Nie stwierdzono także formowania się chromosomów, co jest niezbędne przy podziale mitotycznym komórek [Norberg i Söderström 1967]. Norberg i Söderström sugerowali początkowo, że pojawienie się szczelin w jądrze wynika ze skurczu włókien połączonych z błoną jądrową i innymi strukturami wewnątrzjądrowymi [Norberg i Söderström 1967]. Później jednak zauważono, iż czynnik powodujący powstawanie szczelin działa na jądro od zewnątrz, tj. od strony cytoplazmy [Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967]. Wykazano, że do podziału na segmenty dochodzi w trakcie skurczu filamentów opasujących jądro [Ito 1974, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967]. Sama zaś RS spowodowana jest kurczeniem się, w wyniku powolnego rozpadu, mikrotubul wychodzących z rejonu centrosomu na jednym biegunie a schodzących się w podobnym miejscu na drugim biegunie komórki [Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Norberg 1969, Norberg 1970, Norberg 1967, Norberg i Söderström 1967]. Opasujące jądro mikrotubule uważane są za pozostałość wrzeciona podziałowego [Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Norberg 1969, Norberg 1970, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973, Valmin 1976]. Przedstawiono to schematycznie na rysunku 1. Za udziałem mikrotubul w mechanizmie powstawania RS przemawiają też wyniki badań nad wpływem substancji hamujących podział komórek – blokerów metafazalnych [Borucka-Sztobryn 1985, Norberg 1969, Norberg 1970, Sikora 1996]. Substancje takie jak kolchicyna, demekolina, podofilina, doprowadzając do przyśpieszonego rozpadu mikrotubul wrzeciona podziałowego, blokują podział komórki a równocześnie hamują powstawanie radialnej segmentacji [Borucka-Sztobryn 1985, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Ito 1974, Norberg 1969, Norberg i Söderström 1967, Norberg i Uddman 1973]. Uderzające podobieństwo rozmieszczenia mikrotubul w komórkach z jądrem segmentowanym, u ludzi chorych na białaczkę i w komórkach, w których segmentację jądra indukowano szczawianami, przemawia za udziałem tych struktur włóknistych w procesie tworzenia RS [Cawley 1972, Norberg 1969, Valmin 1976]. Zauważono również, że cytoplazma komórek z jądrem segmentowanym jest silnie zwakuolizowana i posiada zwiększoną ilość protofilamentów, podjednostek wykorzystywanych do budowy mikrotubul [Norberg 1970].

Obok procesów, które cechuje zwiększona zdolność komórek do tworzenia szczelin w jądrze, opisano również takie, w których obserwowano upośledzenie powstawania RS. Na tej podstawie niektórzy sugerują, iż u człowieka zjawisko RS może być obiektywnym przejawem zmienionej odczynowości limfocytów [Borucka-Sztobryn 1985, Starzyńska i Kieszek 1988].

W dostępnej literaturze, tylko nieliczne dane dotyczą radialnej segmentacji jąder limfocytów krwi obwodowej u zwierząt. We wcześniejszych badaniach własnych
[Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Graczyk i Pliszczak-Król 1996, Pliszczak-Król i Graczyk 1995] wykazano, że zjawisko to występuje także u ptaków. W niewielkim zakresie RS pojawia się spontanicznie, ale może być indukowana na drodze chemicznej.

W zaplanowanym układzie doświadczalnym podjęto więc badania mające na celu ocenę zdolności tworzenia radialnej segmentacji jąder (RS) w zestawieniu z aktywnością fosfatazy kwaśnej (Fk) w limfocytach krwi kurcząt, którym:



  • zmieniono czynność układu limfatycznego poprzez operacyjne usunięcie narządów limfatycznych,

  • stymulowano czynność komórek limfatycznych, podając wybrane antygeny.



1   2   3   4


©operacji.org 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna