Rozporządzenie komisji (WE) nr 2771/1999


Ilustracja 3: Urządzenie do płukania



Pobieranie 0,49 Mb.
Strona3/6
Data15.02.2018
Rozmiar0,49 Mb.
1   2   3   4   5   6

Ilustracja 3: Urządzenie do płukania





Ssąca pompa wodna

Przewód 1

Przewód 2

Czynnik płuczący

Kolba filtracyjna

Kolumna szklana



Do napełniania kolumny służy urządzenie takie jak zostało przedstawione na ilustracji 1. Zgodnie z punktem 4.9 faza stacjonarna wprowadzana jest do kolumny plastikowej do wysokości oznakowania. Niższy koniec kolumny szklanej, który ma zostać wypełniony zostaje zaplombowany za pomocą korka z waty szklanej o długości około 1 cm, który został uprzednio silanizowany, oraz który został wciśnięty za pomocą stalowego pętu. Następnie koniec kolumny zostaje zamknięty za pomocą sita zgodnie z częścią 5.3.2.
Kolumna zostaje wypełniona (N2) pod ciśnieniem (3 bar) za pomocą fazy stacjonarnej. W celu uzyskania jednorodnego, nieprzerwanego oraz zbitego upakowania, podczas wypełniania należy przesuwać wibrator w górę oraz w dół kolumny szklanej.
Po zakończeniu wypełniania do drugiego końca upakowanej kolumny zostaje wciśnięty twardy korek z silanizowanej wełny szklanej. Wystające końcówki zostają odcięte a korek wciśnięty do kolumny na głębokość kilku milimetrów za pomocą szpatułki.
6.3 Przygotowanie próbek
Przygotowanie próbek odbywa się za pomocą jednej z trzech następujących metod:
6.3.1 Oddzielenie tłuszczu mlekowego od masła
5 do 10 g masła zostaje rozpuszczone w odpowiednim naczyniu w kąpieli wodnej zgodnie z częścią 5.7, w temperaturze 50o C.
Naczynie Erlenmeyer`a o pojemności 50 ml oraz lejek z wstawionym filtrem zgodnie z częścią 5.14 zostają podgrzane w kabinie suszącej do temperatury 50o C. Warstwa tłuszczu rozpuszczonej próbki masła zostaje poddana filtrowaniu przy użyciu podgrzanego wstępnie urządzenia.
Taki tłuszcz mlekowy jest niemalże całkowicie wolny od fosfolipidów.
6.3.2 Ekstrakcja cząsteczki tłuszczu według metody Rose-Gottlieb`a.
Ekstrakcja przeprowadzana jest albo zgodnie ze Standardem IDF 1 C: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 bądź 22B: 1987.
Przy takim tłuszczu mlekowym, fosfolipidy umożliwiają uzyskanie szczytu cholesterolowego, który jest zwiększony o około 0,1%.
Spektrum triglicerydowe znormalizowane do 100 za pomocą cholesterolu zostaje tym samym zmienione wyłącznie w nieznacznym zakresie.
6.3.3 Ekstrakcja z mleka przy użyciu kolumn z krzemionką koloidalną
0,7 ml próbki mleka schłodzone do temperatury 20o C zostaje wprowadzone do kolumny Extrelut o pojemności od 1 do 3 ml, za pomocą pipety mikrolitrowej, zgodnie z częścią 5.4, oraz pozostawione w celu równomiernego rozprowadzenia na krzemionce koloidalnej, na czas około pięciu minut.
W celu denaturowania zespołów białkowo-lipidowych, za pomocą pipety dodane zostaje 1,5 ml metanolu. Następnie, próbka zostaje ekstrahowana za pomocą 20 ml n-heksanu. N-heksan jest dodawany powoli w niewielkich ilościach, natomiast odsączony rozpuszczalnik zostaje zebrany w naczyniu z okrągłym dnem o pojemności 50 ml oraz wysuszony do stałej oraz znanej wagi.
Po dokonaniu ekstrahowania należy pozostawić kolumnę w celu jej całkowitego osuszenia.
Rozpuszczalniki zostają wydestylowane z eluatu w ewaporatorze rotacyjnym w kąpieli wodnej o temperaturze od 40 do 50o C.
Naczynie zostaje osuszone a uzyskany tłuszcz oznaczony w drodze ważenia.
Uwaga: Analiza triglicerydowa nie jest dostosowana do przeprowadzania ekstrakcji według Gerber`a, Weibull`a-Berntrop`a, Schmid`a-Bondzynskiego-Ratzlaff`a oraz do metody oddzielenia tłuszczu mlekowego przy użyciu detergentów (metoda BDI), dlatego że przy stosowaniu tych metod mniejsze bądź większe ilości częściowych glicerydów lub fosfolipidów mogą przeniknąć do fazy tłuszczowej.
6.4 Przygotowanie roztworu próbki
Do celów chromatografii gazowej wykorzystywany jest 5% roztwór tłuszczu w n-heptanie uzyskany zgodnie z częścią 6.3. W celu sporządzenia takiego roztworu próbki, odpowiadające wielkości materiału próbki uzyskane zgodnie z częściami 6.3.1 oraz 6.3.2 zostają odważone oraz rozpuszczone w odpowiadających wielkościach n-heptanu.
Przy przygotowywaniu próbki zgodnie z częścią 6.3.3 wielkość n-heptanu, która ma być dodana do materiału próbki w naczyniu, jest obliczana na bazie ważenia i pozostanie rozpuszczona w tym naczyniu.
Około 1 ml roztworu próbki zostaje wprowadzony do ampułki zgodnie z częścią 5.1.6.
6.5 Chromatograficzne oznaczanie triglicerydów
W wysokich temperaturach, do 350o C stosowanych przy wymywaniu długo-łańcuchowych triglicerydów C52-C56 łatwo zachodzi wzrost w linii podstawowej, szczególnie gdy kolumny nie zostały na początku wystarczająco przygotowane do badań. Można całkowicie zapobiec temu wzrostowi w linii podstawowej w wysokich temperaturach poprzez albo łączenie dwóch kolumn, albo odejmowanie linii podstawowej.
Stosując sposób kompensacyjny bądź działanie przy zastosowaniu pojedynczych kolumn, zastosowane muszą zostać szczelne korki grafitowe, zgodnie z częścią 5.5, zarówno do wkładów szklanych w iniektorze jak i w detektorze.
6.5.1 Korekta linii podstawowej
Aby uniknąć wzrostu w linii podstawowej stosuje się jedną z następujących czterech metod:
6.5.1.1 Połączenie kolumn
W sposobie kompensacyjnym stosowane są dwie upakowane kolumny.
6.5.1.2 Korekta linii podstawowej za pomocą chromatografu gazowego
Wzrostu linii podstawowej można uniknąć poprzez zastosowanie przebiegu przez chromatograf gazowy bez wstrzykiwania roztworu tłuszczu oraz następującego po tym odjęcia zapisanej linii podstawowej.
6.5.1.3 Korekta linii podstawowej za pomocą programu integracyjnego
Wzrostu linii podstawowej można uniknąć poprzez zastosowanie przebiegu przez system integracyjny bez wstrzykiwania roztworu tłuszczu oraz następującego po tym odjęcia zapisanej linii podstawowej.
6.5.1.4 Korekta linii podstawowej za pomocą odpowiedniego przygotowania kolumny do badań
Przy odpowiednim wstępnym przygotowaniu kolumny do badań oraz średnio 20 dokonanych wtryskach za pomocą roztworów tłuszczu mlekowego wznoszenie się linii podstawowej w wysokich temperaturach jest często tak niewielkie, że korekcje linii podstawowej nie są konieczne.
6.5.2 Technika wtryskowa
Technika „gorących wtrysków” stosowana jest w celu uniknięcia efektów wykluczających oraz w celu uzyskania lepszych wyników ilościowych za pomocą mających wysoką temperaturę wrzenia składników triglicerydowych. W tej technice roztwór tłuszczu wciągany jest do strzykawki a zimna igła strzykawki jest ogrzewana przed dokonaniem wtrysku przez około trzy sekundy w głowicy wtryskiwacza. Następnie, zawartość strzykawki zostaje gwałtownie wtryśnięta.
Uwaga: w omawianej technice wtryskowej zmniejszone jest niebezpieczeństwo powstania zjawiska frakcjonowania wewnątrz strzykawki oraz powstania bloku wtryskowego. Bezpośrednie wtryśnięcie „do kolumny”, w jej górnej bardziej ogrzanej części nie jest stosowane, ponieważ akumulujące się w tym miejscu fragmenty przegrody, jak również zanieczyszczenia mogą zostać łatwo usunięte w stosowanej technice w drodze regularnego wymieniania wkładu wtryskiwacza bez rozmontowywania kolumny.
Należy z całą surowością unikać zginania końcówki igły w wyniku dotykania dna zlewki z dziobkiem (nawet gdy jest ono trudno widzialne), aby nie doprowadzić do uszkodzenia przegrody.




Ilustracja 4: Chromatogram triglicerydowy próbki tłuszczu mlekowego





  1. zła rozdzielczość w wyniku uszkodzonej przeszkody




  1. dobra rozdzielczość

6.5.3 Przygotowanie upakowanej kolumny do badań


Podczas wykonywania czynności od (a) do (c) góra kolumny nie jest podłączona do detektora w celu uniknięcia zanieczyszczenia.
Wypełnione kolumny zgodnie z częścią 6.2 są w następujący sposób przygotowywane do badań:


  1. 15 min 40 ml/min N2 – przepływ w temperaturze 50o C;




  1. Podgrzewanie przy 1 K/min do temperatury 355o C przy 10 ml N2/min;




  1. Przetrzymywanie przez 12 do 15 h w temperaturze 355o C;




  1. Dokonanie dwóch wtrysków o wielkości 1 mikrometra roztworu masła kakaowego zgodnie z częścią 4.10 oraz właściwym programem temperatury;




  1. Dokonanie 20 wtrysków o wielkości 0,5 mikrometra roztworu tłuszczu mlekowego w czasie od dwóch do trzech dni, zgodnie z częścią 6.4.


Uwaga: Masło kakaowe składa się niemalże wyłącznie z triglicerydów od C50 – do C56 o wysokiej temperaturze wrzenia. Wtryskiwanie masła kakaowego wymaga specjalnego przygotowania do badań w tym długołańcuchowym zakresie. Przy triglicerydach C50 do C54 o wysokiej temperaturze wrzenia mogą wystąpić czynniki responsywne średnio do 1,20. Zazwyczaj, przy powtarzanym wtrysku roztworu tłuszczu mlekowego należy oczekiwać zmniejszenia początkowo wysoko responsywnych czynników dla C50 do C54.W przypadku triglicerydów o niskiej liczbie acyl-c czynniki są zbliżone do 1. Przygotowane zostają, odpowiednio, trzy pary kolumn wypełnione zgodnie z częścią 6.2. Przygotowane do badań pary zostają odpowiednio sprawdzone za pomocą analizy tłuszczu mlekowego w ramach testów rutynowych.
Para dająca najlepsze wyniki ilościowe (czynniki responsywne równe niemalże 1) zostaje wykorzystana w dalszej części. Kolumna z czynnikami responsywnymi o wartości > 1,20 nie jest wykorzystywana.
6.5.4 Kalibracja
W celu kalibracji oznaczone zostają czynniki responsywne odpowiadających triglicerydów, jak również cholesterol w tłuszczu mlekowym (tłuszcz standaryzowany), przy użyciu standaryzowanych triglicerydów (przynajmniej nasyconych triglicerydów C24, C30, C36, C42, C48 oraz C54, jak również cholesterolu; i najlepiej dodatkowo C50 oraz C52). Czynniki responsywne pośrednie mogą zostać odkryte w drodze interpolacji matematycznej.
Przy użyciu tłuszczu standaryzowanego codziennie muszą zostać przeprowadzone dwie do trzech kalibracji. W przypadku gdy uzyskane zostają niemal identyczne wyniki, uzyskiwane są dobrze odtwarzalne wyniki ilościowe za pomocą analizy triglicerydowej próbek.
Trwałość standaryzowanego tłuszczu mlekowego w składowaniu wynosi kilka miesięcy w temperaturze składowania wynoszącej maksymalnie - 18o C i może być tym samym wykorzystywany jako standard.
6.5.5 Program temperatury, gaz nośny oraz inne warunki dla analizy triglicerydowej
Program temperatury: wstępna temperatura kolumny wynosi 210 o C, utrzymywać przez jedną minutę, następnie zaprogramować na 6 o C/min do 350 o C oraz przetrzymywać w temperaturze przez pięć minut.
Temperatura detektora oraz wtryskiwacza: 370o C, odpowiednio.
Uwaga: Temperatury (temperatura wstępna) detektora, wtryskiwacza oraz pieca są utrzymywane na stałym poziomie (również w ciągu nocy, podczas przerwy sobotnio-niedzielnej oraz świąt) .
Gaz nośny: azot, wielkość przepływu 40 ml/min.
Uwaga: W przypadku gdy stosowane są osiemdziesięciocentymetrowe kolumny, wielkość przepływu musi wynosić co najmniej 75 ml/min N2. Przepływ gazy nośnego musi być stale utrzymywany (również w ciągu nocy, podczas przerw sobotnio-niedzielnych oraz świąt). Dokładna wielkość przepływu gazu nośnego musi zostać dostosowana w taki sposób aby, niezależnie od długości kolumny, C54 był wypłukiwany w temperaturze 341o C.
Czas trwania analizy: 29,3 minuty.
Wielkość wtrysku: 0,5 mikrometra.
Uwaga: Strzykawka musi być kilkakrotnie płukana czystym heptanem po każdym wtrysku.
Warunki FID: zgodnie z częścią 5.1
Uwaga: Detektor jonizacji płomieni jest zapalany, odpowiednio, w chwili rozpoczęcia każdego dnia roboczego.


  1. Integracja, ocena oraz kontrola warunków pomiarowych

Triglicerydy o nieparzystej liczbie acyl-c (2n + 1) zostają połączone z poprzednimi triglicerydami o liczbie parzystej (2n). Mniej odtwarzalne, o niskich zawartościach C56 nie są brane pod uwagę. Pozostałe na chromatogramie triglicerydy (obszar wierzchołków), włącznie z cholesterolem (wierzchołek bliski C24) zostają pomnożone przez odpowiednie czynniki responsywne standardowego tłuszczu (ostatnia kalibracja) oraz wspólnie znormalizowane do 100. Obok wolnego cholesterolu, tym samym, oceniane są triglicerydy C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 oraz C54. Wyniki podawane są w % wagowych (g/100 g).


Ocena wierzchołków chromatogramu zostaje przeprowadzona przy pomocy integratora, przy pomocy którego wyrysowana może zostać linia podstawowa. Możliwa jest ponowna integracja przy pomocy zoptymalizowanych parametrów integracyjnych.
Ilustracje 5 oraz 6 przedstawiają dwa przykłady chromatogramów triglicerydowych. Ilustracja 5 przedstawia chromatogram, który może zostać łatwo oceniony, podczas gdy ilustracja 6 przedstawia sporadyczny błąd w zakresie od C50 do C54 oraz linię podstawową biegnącą w sposób niepoprawny w porównaniu do linii podstawowej przedstawionej na ilustracji 5. Takie błędy mogą z dużą dozą pewności zostać wykryte oraz można ich uniknąć poprzez zastosowanie integratora, przy pomocy którego wyrysowywana jest linia podstawowa.





Ilustracja 5: Łatwy do oceny chromatogram triglicerydowy tłuszczu mlekowego z

wpisaną linią podstawową

Niepoprawna integracja





1   2   3   4   5   6


©operacji.org 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna